本发明专利技术提供了一种携带抗肿瘤蛋白靶向性exosome的制备方法，包括以下步骤：(1)构建表达肿瘤靶向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗肿瘤蛋白PINT-87aa的融合基因表达质粒；(2)将表达质粒转染到人的胚肾细胞HEK293细胞中，puro抗生素筛选获得稳定表达抗肿瘤融合蛋白的细胞系；(3)细胞扩增培养，对细胞释放出来的携带抗肿瘤蛋白的exosome进行分离纯化。本发明专利技术的方法成功构建了一种仿生物源性抗肿瘤蛋白输送载体，能够高效抑制肿瘤的生长，为恶性的治疗提供了一种潜在的理想的治疗方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子细胞生物学领域，具体涉及一种携带抗肿瘤蛋白革E1向性exosome 的制备方法及其应用。
技术介绍
药物传输系统(drug delivery system)是指为提高疗效，在防治疾病的过程中， 人们采用多种治疗药物的不同的给予药物的方法，目前药物传输系统分为以下几种:缓释、 控释给药系统;靶向给药系统;脉冲式给药系统;经皮给药系统等。 外泌体（exosome)是直径约为30-lOOnm、密度为1.13-1.21g/ml的囊泡，是由细胞 分泌的纳米级颗粒。外泌体广泛天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳及体外细 胞培养液。外泌体最早由Trams等于1981年在正常细胞和肿瘤细胞培养上清液中被发现。外 泌体属于生物体内囊泡的一种，早期的研究认为，外泌体执行蛋白运输功能，特异靶定受体 细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。直到2007年，研究人员发现外泌体也运输核 酸，参与细胞间通讯。2013年美国、德国3位科学家James、Randy W和Thomas C因发现细胞内 的主要运输系统一一囊泡运输的调节机制，荣获2013年诺贝尔生理学或医学奖。外泌体由 于携带多种蛋白质、miRNA、ncRNA，作为细胞物质运输的载体发挥重要的生物学功能。例如， 肿瘤细胞分泌的外泌体能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，而树突状细胞源性外 泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。目前研究发现，外泌体内含有与细胞来源相 关的蛋白质、RNA等，成为细胞物质运输的天然载体，2011年Matthew等人通过构建携带沉默 siRNA-BACEl的人工外泌体，将药物突破血脑屏障靶向送入大脑细胞，可见外泌体有望成为 一种新型天然的理想药物运输载体。 我们前期研究发现了一种天然的抗肿瘤蛋白，该蛋白由人的LINC-PINT基因（基因 登录号NR_015431)编码，该蛋白是由87个氨基酸组成的分子量为9.6KD的小蛋白，命名 PINT_87aa;细胞功能学研究发现该蛋白可以进入外泌体(exosome)被细胞分泌出去，发挥 抑制肿瘤细胞生长的作用。Lamp2b基因属于外泌体膜上的一种蛋白，由研究者将目标蛋白 与此蛋白融合表达，可以将目标蛋白装载到外泌体中。肿瘤穿透肽iRGD(CRGDK/RGHVEC)是 由9个氨基酸组成的肿瘤革E1向性多肽，2010年Kazuki Sugahara等用这种可穿透实体肿瘤的 iRGD多肽以化学方式和抗肿瘤药物发生结合使得药物进入到体内生长的肿瘤的血管外组 织之中，发挥强效的抗肿瘤药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效抑制肿瘤生长的 仿生物源性抗肿瘤蛋白输送载体。 为此，本专利技术提供了如下技术方案。 -种携带抗肿瘤蛋白革巴向性exosome的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1)构建表达肿瘤靶向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗肿瘤蛋白PINT- 87aa的融合基因表达质粒； (2)将表达质粒转染到人的胚肾细胞HEK293细胞中，puro抗生素筛选获得稳定表 达抗肿瘤融合蛋白的细胞系； (3)细胞扩增培养，对细胞释放出来的携带抗肿瘤蛋白的exosome进行分离纯化。 优选地，所述步骤(1)中，所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 优选地，所述步骤（1)中，将编码LAMP2蛋白的核苷酸序列，去掉终止密码子后添加 T2A多肽连接子与PINT-87aa蛋白连接，lamp2b的另一端连接编码iRGD的核苷酸序列，获得 此片段后通过NheI、BamHI两个限制性内切酶将所述片段连接到pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP+ Puro质粒中。 优选地，所述步骤(2)中，将HEK293细胞50万个细胞接种于6孔板培养板中，24h细 胞贴壁后可进行转染；转染前，将100微升无血清培养基DMEM和5微升表达质粒制成质粒 MIX1混合液;将100微升无血清培养基DMEM+6微升liop2000脂质体均匀混合，制成脂质体 MIX2混合液;将ΜΙΧΓ混合液和MIX2混合液等比例混合，室温放置20min;按照转染试剂操作 说明书操作;最终6孔板中的孔终体积为1毫升，转染6小时后，换成1毫升普通培养基，细胞 培养条件为37°C、5% (体积浓度)二氧化碳;细胞培养48小时后，换用终浓度为2mg/L的puro 嘌呤霉素进行筛选，隔日换液，筛选5天后，建立稳定表达抗肿瘤蛋白PINT-87aa的HEK293细 胞系。 优选地，所述正常培养基为DMEM培养基加10%胎牛血清和1 %青霉素-链霉素，以 上百分比为体积百分比。 优选地，所述步骤（3)中，采用差异离心的方法从HEK293培养细胞液中分离纯化 exosome〇 优选地，所述步骤(3)包括：当HEK293细胞培养到80 %融合度的时候，撤去培养基， PBS洗涤细胞3遍，换成无血清无双抗的基础培养基DMEM，继续培养细胞48小时;之后收取细 胞培养上清，按照如下操作分离纯化培养上清中的exosome:所述细胞培养上清置于50ml离 心管中，4°C、1000 X g离心5min，去除较大的细胞碎片，取第一上清;然后将所述第一上清于 4°C、16500 X g离心30min，取第二上清;然后将所述第二上清于4°C、100000 X g离心2h，弃上 清，取第一沉淀;将所述第一沉淀用lml PBS吹打洗涤，然后4 °C、100000 X g离心2h，弃上清， 取第二沉淀；然后再用roS洗涤所述第二沉淀，于4°C、100000 X g离心2h，最后得到第三沉 淀，即为分离纯化后的exosome。 本专利技术还提供了所述方法制备获得的exosome在制备用于抑制肿瘤生长的药物中 的应用。 本专利技术将抗肿瘤蛋白PINT-87aa与肿瘤靶向性多肽iRGD及exosome的膜蛋白 lamp2b融合，构建基因融合表达质粒，将质粒转染到供体细胞HEK293中，嘌呤霉素 puro筛选 构建稳定表达融合蛋白的细胞株。我们将构建的稳定表达抗肿瘤蛋白融合基因的供体细胞 扩增培养，提取细胞分泌的exosome，并采用恶性脑胶质瘤细胞U251对exosome的功能效果 进行测试。细胞功能学实验结果显示，本专利技术人工制备的exosome能够有效的抑制肿瘤细胞 U251的生长。由此可见，本专利技术成功构建了一种仿生物源性抗肿瘤蛋白输送载体，能够高效 抑制肿瘤的生长，为恶性的治疗提供了一种潜在的理想的治疗方法。【附图说明】图1是抗肿瘤蛋白PINT-87aa与肿瘤祀向性多肽iRGD及exosome的膜蛋白lamp2b融 合表达质粒的构建示意图。图2是供体细胞HEK293稳定表达抗肿瘤蛋白PINT-87aa的荧光图片。 图3是蛋白检测exosome中PINT_87aa的表达情况。图4是MTT检测抗肿瘤exosome抑制脑胶质瘤细胞U251的增殖实验结果。【具体实施方式】下面结合具体实施例和附图作进一步的详述，但本专利技术并不限于以下实施例。除 非另外指出，本专利技术及以下实施例中所涉及的术语、英文缩写均为本领域技术人员可理解。 一 ：肿瘤革巴向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗肿瘤蛋白PINT_87aa的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种携带抗肿瘤蛋白靶向性exosome的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建表达肿瘤靶向性多肽iRGD、exosome膜蛋白lamp2b及抗肿瘤蛋白PINT‑87aa的融合基因表达质粒；(2)将表达质粒转染到人的胚肾细胞HEK293细胞中，puro抗生素筛选获得稳定表达抗肿瘤融合蛋白的细胞系；(3)细胞扩增培养，对细胞释放出来的携带抗肿瘤蛋白的exosome进行分离纯化。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张弩，张茂雷，严圣，杨毅兵，何科君，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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