【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种角膜浑浊小鼠模型的构建方法及应用。
技术介绍
1、角膜混浊是指由于感染、外伤或者化学物侵袭导致角膜出现瘢痕或者云翳，使角膜透明度下降的病理表现。角膜瘢痕组织阻碍光线到达视网膜从而影响视力，严重的角膜混浊会致盲，因此维持角膜透明对于良好的视力至关重要。目前，角膜混浊的治疗方法主要是给予抗生素、类固醇或者激光治疗，而严重的角膜混浊只能通过角膜移植手术进行治疗。2013年世界卫生大会制订了《2014-2019年全球眼部健康计划》——减少视力损害，倡议2010年-2019年期间将可避免的视力损害患病率降低25％。根据世界卫生组织的报道，角膜混浊是导致眼盲的重要原因之一，2020年全球至少有2.9百万人因角膜混浊而导致视力受损，约1.3百万人因角膜混浊导致眼盲，并且患病数量呈现一个逐步上升的现象。经济负担上，眼表面疾病的经济负担越来越严重，据美国健康管理系统统计，从个人层面上来讲治疗眼表疾病的费用接近40亿美元，而社会承担的经济损失约550亿美元，而在亚洲预估的治疗费用高于美国。所以，角膜混浊致病机制的探究一直是该领域的研究热点，也是该疾病亟需解决的问题。近年来，人们对rna表观遗传学有了更深入的认识，研究发现rna表观遗传调控许多疾病的发生发展。基因转录后有一百多种修饰，这些修饰影响了rna的翻译和稳定性，其中假尿苷修饰是生物体rna丰度最高的表观遗传修饰。目前尚未有人研究假尿苷修饰与角膜混浊疾病之间的关系，本课题旨在阐明假尿苷修饰合酶pus7在角膜组织基因在维持角膜稳态中的作用及机制。
2、
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种角膜浑浊小鼠模型的构建方法及应用。本专利技术首次揭示了pus7基因(假尿苷合酶7)在角膜稳态中的重要作用，pus7敲除或点突变导致小鼠自发性的角膜混浊表型，为研究假尿苷修饰合酶pus7基因和角膜稳态的关系提供新的思路。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
3、第一方面，本专利技术提供了一种pus7基因点突变小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
4、(1)利用donor和crispr/cas9技术选取小鼠的第五号染色体上pus7基因进行点突变设计；所述点突变为将pus7基因的201号转录本第7号外显子上的293位的天冬氨酸d突变为丙氨酸a；
5、(2)突变完成后，进行基因型鉴定，筛选得到pus7 d293a/d293a纯合型点突变小鼠，即为pus7基因点突变小鼠模型。
6、rna表观遗传调控许多疾病的发生发展，其中，假尿苷修饰是生物体rna丰度最高的表观遗传修饰。本专利技术在研究假尿苷修饰与角膜混浊疾病之间的关系的过程中，发现假尿苷合酶家族中的pus7基因在角膜组织中的表达水平显著高于其它基因，通过crispr/cas9技术构建了pus7基因点突变小鼠模型，可导致小鼠出现自发性的角膜混浊表型。本专利技术构建的角膜混浊的小鼠模型，可用于角膜混浊的基础研究及相应的药物筛选。
7、所述小鼠的pus7基因的dna序列可从ncbi上查询。
8、优选地，所述基因型鉴定的方法为sanger测序。
9、第二方面，本专利技术提供了上述的构建方法构建得到的pus7基因点突变小鼠模型。
10、第三方面，本专利技术提供了pus7基因敲除模型或上述的pus7基因点突变小鼠模型在治疗角膜混浊的药物筛选中的应用。
11、本专利技术经大量研究发现，pus7基因敲除小鼠模型以及pus7基因点突变小鼠模型，均能导致小鼠出现自发性的角膜混浊表型，pus7的敲除后会导致角膜修复失败，角膜发生混浊病变。本专利技术首次揭示了pus7基因(假尿苷合酶7)在角膜稳态中的重要作用，为研究假尿苷修饰合酶pus7基因和角膜稳态的关系，探究角膜混浊致病机制提供新的思路。本专利技术构建的角膜混浊的小鼠模型，可用于角膜混浊的基础研究及相应的药物研发和筛选。
12、优选地，所述pus7基因敲除小鼠模型通过如下方法进行构建：利用crispr/cas9技术设计grna敲除小鼠基因组上的pus7基因1号和2号外显子之间的基因片段，而后进行基因型鉴定，筛选得到pus7-/-纯合型基因敲除小鼠，即为pus7基因敲除小鼠模型。
13、优选地，所述grna的引物序列为grna1：5’-tgggttcattgtaatcgtacagg-3’；grna2：5’-catgcggggcttttgatcacagg-3’。
14、优选地，所述基因型鉴定所用的引物为：primer-pus7-/--f：5’-atggatcggaggtaagggcactt-3’；primer-pus7+/+-f：5’-taccaccctctacacacacattaacaacc-3’；primer-r：5’-taccaccctctacacacacattaacaacc-3’。
15、第四方面，本专利技术还提供了pus7基因作为靶点在制备治疗角膜浑浊的药物中的应用。
16、优选地，所述pus7基因通过il6/stat1信号通路调控角膜稳态。
17、本专利技术在对假尿苷修饰合酶pus7在角膜组织中在维持角膜稳态中的机制研究中发现，pus7缺失导致角膜的角化基因、血管基因和炎症相关基因的表达水平显著上调。富集到的kegg信号通路主要是细胞因子-细胞因子受体的相互作用、类风湿性关节炎、趋化因子信号通路和jak/stat信号通路等，这些通路与炎症反应的关系密切。进一步的研究发现，pus7基因敲除小鼠和pus7基因点突变小鼠角膜中的stat1表达升高，磷酸化stat1的入核明显增多，stat1上游的细胞因子il6的分泌也明显增多。因此，pus7基因缺失异常激活了il6/stat1信号通路。
18、优选地，所述药物为抑制il6/stat1信号通路的药物。
19、在上述研究中，本专利技术证明了pus7基因敲除是通过异常激活il6/stat1信号通路导致的，芦可替尼抑制剂的给药可以治疗pus7敲除小鼠的角膜混浊表型。
20、本专利技术的有益效果为：
21、本专利技术首次揭示了pus7基因(假尿苷合酶7)在角膜稳态中的重要作用，pus7敲除或点突变导致小鼠自发性的角膜混浊表型，为研究假尿苷修饰合酶pus7基因和角膜稳态的关系提供新的思路。本专利技术构建的角膜混浊的小鼠模型，可用于角膜混浊的基础研究及相应的药物研发和筛选。
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1.一种Pus7基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因型鉴定的方法为sanger测序。
3.如权利要求1-2任一项所述的构建方法构建得到的Pus7基因点突变小鼠模型。
4.Pus7基因敲除模型或如权利要求3所述的Pus7基因点突变小鼠模型在治疗角膜混浊的药物筛选中的应用。
5.Pus7基因作为靶点在制备治疗角膜浑浊的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Pus7基因通过IL6/STAT1信号通路调控角膜稳态。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制IL6/STAT1信号通路的药物。
【技术特征摘要】
1.一种pus7基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因型鉴定的方法为sanger测序。
3.如权利要求1-2任一项所述的构建方法构建得到的pus7基因点突变小鼠模型。
4.pus7基因敲除模型或如权利要求3所述的pus7基因点...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏培强，徐彩霞，苏得莹，廖智恒，周太峰，陈树清，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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