一种肿瘤靶向丝胶蛋白胶束及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医药材料技术领域，公开了一种肿瘤靶向丝胶蛋白胶束及其制备方法和应用。本发明专利技术方法以生物相容性良好、可生物降解的水溶性天然蛋白丝胶蛋白为原料，室温条件下合成含有疏水性胆固醇基团的两亲性丝胶蛋白衍生物，进一步通过化学反应偶联叶酸，制备得到靶向两亲性丝胶蛋白衍生物，其在水溶液中与疏水性药物IR780通过自组装可以形成载药纳米胶束。该纳米胶束体系能够有效增加药物在血液循环中的稳定性以及降低药物的毒副作用，因而在制备肿瘤诊断制剂或治疗药物中具有很好的研究价值和应用前景。

Tumor targeting sericin protein micelle and preparation method and application thereof

The invention belongs to the technical field of biological medicine materials, and discloses a tumor targeted sericin protein micelle, a preparation method and an application thereof. The method of the invention with good biocompatibility and biodegradable natural water-soluble sericin protein as raw material, under the condition of room temperature synthesis containing hydrophobic cholesterol group two amphiphilic derivatives of sericin protein, further through the chemical reaction coupling folic acid was prepared by targeting two amphiphilic derivatives of sericin protein, through self-assembly the formation of micelles in aqueous solution and hydrophobic drug IR780. The nano micelles can effectively increase the stability of the drug in blood circulation and reduce the side effects of drugs, and in the preparation of high research value and good application prospects for tumor diagnosis or treatment of drug preparation.

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤靶向丝胶蛋白胶束及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药材料
，具体涉及一种肿瘤靶向丝胶蛋白胶束及其制备方法和应用。
技术介绍
丝胶蛋白作为一种水溶性糖蛋白，是蚕丝蛋白的重要组成之一，起粘结丝素蛋白纤维的作用。传统上丝胶蛋白经常被视为蚕丝工业的废物。近年来，随着对丝胶蛋白研究工作的深入，这种曾经的蚕丝工业废料，因为具有抗氧化性、优异的保湿性能、促哺乳动物细胞有丝分裂和低免疫原性等诸多生物活性，开始广泛应用于制药、化妆品、食品和生物科技领域(DavidL.Kaplan,etal,ProgressinPolymerScience,2008,33,998-1012)。丝胶蛋白分子结构中含有极性侧链和疏水区域，具有两亲性特质，可以自组装成纳米胶束，用作药物或活性物质的递送载体。单纯的丝胶蛋白通过自组装形成的粒子，粒径大小在500～1000nm之间，体内循环容易累积在肝脏和被网状内皮系统吞噬。将合成高分子聚乙二醇和普朗尼克与丝胶蛋白自组装可以使丝胶蛋白纳米粒子的大小压缩至药物纳米载体的最佳尺寸之内(K.Y.Choetal,InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2003,32,36-42；SCKundu,etal,Nanotechnology,2009,20,355101)。华中科技大学王琳课题组将肿瘤靶向配体分子叶酸和疏水性药物阿霉素偶联到丝胶蛋白上构建酸敏感的肿瘤靶向纳米载体，用于宫颈癌治疗(WangLin,etal,ACSAppliedMaterials&Interfaces,2016,8,6577-6585)。目前的国内外研究存在许多不足和改善空间，比如用到的聚乙二醇和普朗尼在体内不可降解，并且胶束在体内循环的稳定性不够好，比如阿霉素作为一种广谱抗癌药物，对胃癌、胰腺癌等疗效不佳，增加丝胶纳米载体在体内的循环、提高载药量和疗效、扩大载体的应用范围，等等。IR780(2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓碘化物)是一种有机小分子近红外染料，具有优良的光学和生物学性质。作为一种亲脂性阳离子化合物，IR780可以优先聚集在细胞膜电位更高的癌细胞，从而实现被肿瘤细胞选择性摄取。此外，IR780在近红外区具有独特的光学性质，吸收特定波长的近红外光会产生荧光、高热和活性氧，产生的近红外荧光具有很好的穿透性，能够穿透组织成像，产生的高热破坏肿瘤组织内部的血管，活性氧诱导肿瘤细胞凋亡或坏死，用作肿瘤成像、光动力学和光热联合治疗，有望实现诊疗一体化(ZhangC,etal,Biomaterials,2010,31,6612-6617；YueC,etal,Biomaterials,2013,34,6853-6861)。但IR780在应用上也存在很多缺陷，比如亲水性差，在水溶液中容易聚集猝灭，导致量子产率低，而且光稳定性差，游离的IR780容易发生光褪色(JiangC,ActaBiomaterialia,2015,14,61-69)。生物大分子纳米载体具有良好的生物相容性、体内可降解、在体内具有较长的循环时间、可靶向富集到肿瘤组织等优越性能，是改善IR780局限性的理想载体系统之一(WangQ,etal,BiotechnologyAdvances,2015,33,1855-1867)。
技术实现思路
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本专利技术的首要目的在于提供一种肿瘤靶向丝胶蛋白胶束的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的肿瘤靶向丝胶蛋白胶束。本专利技术的再一目的在于提供上述肿瘤靶向丝胶蛋白胶束在制备肿瘤诊断制剂或治疗药物中的应用。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种肿瘤靶向丝胶蛋白胶束的制备方法，包括如下制备步骤：(1)丝胶蛋白的提取：将蚕茧剪成碎片，灭菌后在碱溶液中煮沸，过滤除去丝素蛋白和其他不溶物得到丝胶蛋白溶液，透析除盐，冷冻干燥得到丝胶蛋白干粉；(2)丝胶蛋白-胆固醇衍生物的制备：将步骤(1)得到的丝胶蛋白干粉溶解于有机溶剂中，再加入胆固醇甲酰氯溶液进行反应，反应产物经分离纯化，得到丝胶蛋白-胆固醇衍生物；(3)靶向丝胶蛋白-胆固醇衍生物的制备：将叶酸溶于二甲基亚砜中，加入活化剂避光活化，然后加入步骤(2)得到的丝胶蛋白-胆固醇衍生物的二甲基亚砜溶液，避光反应，反应产物经纯水中透析纯化，冷冻干燥得到靶向丝胶蛋白-胆固醇衍生物；(4)靶向丝胶蛋白胶束的制备：将步骤(3)得到的靶向丝胶蛋白-胆固醇衍生物与IR780溶于有机溶剂，超声辅助下分散于去离子水中，将所得混合液在去离子水中透析除去有机溶剂，得到肿瘤靶向丝胶蛋白胶束。优选地，步骤(1)中所述的灭菌是指用紫外光或乙醇进行灭菌；所述的碱溶液为浓度为0.01～0.05M的碳酸氢钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液或碳酸氢钾溶液；所述煮沸的时间为0.5～1.5h。优选地，步骤(2)中所述的有机溶剂是指二甲基亚砜，所述的胆固醇甲酰氯溶液是指胆固醇甲酰氯的二氯甲烷溶液；所述的分离纯化步骤为：蒸发除去二氯甲烷，然后通过乙醇沉淀，将所得产物重新分散于无水乙醚中，离心分离，弃去上清液，干燥得到丝胶蛋白-胆固醇衍生物。优选地，步骤(2)中所述胆固醇甲酰氯与丝胶蛋白的投料质量比为1:(2～10)。优选地，步骤(3)中所述的活化剂为摩尔比为(1～2):1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；所述叶酸与活化剂中NHS的摩尔比为1:(1～3)。优选地，步骤(3)中所述避光活化的时间为4～12h；所述避光反应的时间为12～36h。优选地，步骤(4)中所述的有机溶剂是指DMSO；所述IR780与靶向丝胶蛋白-胆固醇衍生物的质量比为1:(5～10)。优选地，步骤(4)中所述的透析是指用截留分子量为8000～14000Da的纤维素透析袋进行透析。一种肿瘤靶向丝胶蛋白胶束，通过上述方法制备得到。所述肿瘤靶向丝胶蛋白胶束为球形，直径大小为50～150nm。进一步地，所述肿瘤靶向丝胶蛋白胶束由具有核壳结构的丝胶蛋白-胆固醇衍生物组成，胶束外壳亲水部分接有靶向配体分子叶酸，内核的疏水部分负载疏水性抗癌药物IR780。上述肿瘤靶向丝胶蛋白胶束在制备肿瘤诊断制剂或治疗药物中的应用。本专利技术的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：(1)本专利技术所得肿瘤靶向丝胶蛋白胶束由亲水的丝胶蛋白和疏水的胆固醇组成，并偶联了靶向配体分子叶酸，通过自组装得到的胶束纳米粒子具有优良生物相容性，可体内降解，降解产物无毒并具备肿瘤靶向的优点；(2)本专利技术利用靶向两亲性丝胶蛋白聚合物在水溶液中自组装形成纳米胶束，并负载疏水的近红外染料IR780，具有良好的肿瘤成像效果和光热治疗效果，可望用作一种性能优良的诊疗一体化的纳米药物载体。附图说明图1为本专利技术实施例步骤(2)中丝胶蛋白-胆固醇衍生物的制备反应机理与反应过程示意图；图2为本专利技术实施例步骤(3)中靶向丝胶蛋白-胆固醇衍生物的制备反应机理与反应过程示意图；图3为本专利技术实施例中所得丝胶蛋白和靶向丝胶蛋白-胆固醇衍生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤靶向丝胶蛋白胶束的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：(1)丝胶蛋白的提取：将蚕茧剪成碎片，灭菌后在碱溶液中煮沸，过滤除去丝素蛋白和其他不溶物得到丝胶蛋白溶液，透析除盐，冷冻干燥得到丝胶蛋白干粉；(2)丝胶蛋白‑胆固醇衍生物的制备：将步骤(1)得到的丝胶蛋白干粉溶解于有机溶剂中，再加入胆固醇甲酰氯溶液进行反应，反应产物经分离纯化，得到丝胶蛋白‑胆固醇衍生物；(3)靶向丝胶蛋白‑胆固醇衍生物的制备：将叶酸溶于二甲基亚砜中，加入活化剂避光活化，然后加入步骤(2)得到的丝胶蛋白‑胆固醇衍生物的二甲基亚砜溶液，避光反应，反应产物经纯水中透析纯化，冷冻干燥得到靶向丝胶蛋白‑胆固醇衍生物；(4)靶向丝胶蛋白胶束的制备：将步骤(3)得到的靶向丝胶蛋白‑胆固醇衍生物与IR780溶于有机溶剂，超声辅助下分散于去离子水中，将所得混合液在去离子水中透析除去有机溶剂，得到肿瘤靶向丝胶蛋白胶束。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤靶向丝胶蛋白胶束的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：(1)丝胶蛋白的提取：将蚕茧剪成碎片，灭菌后在碱溶液中煮沸，过滤除去丝素蛋白和其他不溶物得到丝胶蛋白溶液，透析除盐，冷冻干燥得到丝胶蛋白干粉；(2)丝胶蛋白-胆固醇衍生物的制备：将步骤(1)得到的丝胶蛋白干粉溶解于有机溶剂中，再加入胆固醇甲酰氯溶液进行反应，反应产物经分离纯化，得到丝胶蛋白-胆固醇衍生物；(3)靶向丝胶蛋白-胆固醇衍生物的制备：将叶酸溶于二甲基亚砜中，加入活化剂避光活化，然后加入步骤(2)得到的丝胶蛋白-胆固醇衍生物的二甲基亚砜溶液，避光反应，反应产物经纯水中透析纯化，冷冻干燥得到靶向丝胶蛋白-胆固醇衍生物；(4)靶向丝胶蛋白胶束的制备：将步骤(3)得到的靶向丝胶蛋白-胆固醇衍生物与IR780溶于有机溶剂，超声辅助下分散于去离子水中，将所得混合液在去离子水中透析除去有机溶剂，得到肿瘤靶向丝胶蛋白胶束。2.根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向丝胶蛋白胶束的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的灭菌是指用紫外光或乙醇进行灭菌；所述的碱溶液为浓度为0.01～0.05M的碳酸氢钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液或碳酸氢钾溶液；所述煮沸的时间为0.5～1.5h。3.根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向丝胶蛋白胶束的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的有机溶剂是指二甲基亚砜，所述的胆固醇甲酰氯溶液是指胆固醇甲酰氯的二氯甲烷溶液；所述的分离纯化步骤为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张黎明，邓立志，杨立群，郭伟洪，胡彦锋，李国新，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44