CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体制造技术

ＣＨＯ细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体包括两株人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体ＣＨＯ（中国倉鼠卵巢细胞）生产细胞系极其生产的预防和治疗用人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体制剂。其产品特征为来源于噬菌体人源抗体库筛选的与人源ＩｇＧＦｃ基因重组后在中国倉鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞稳定表达细胞的全人源抗体ＩｇＧ１λ和ＩｇＧ１κ，分别命名ＣｈＨＡＩｇＧ１６和ＣｈＨＡＩｇＧ７８。分子量为１５０ｋｄ左右。由ＣｈＨＡＩｇＧ１６和ＣｈＨＡＩｇＧ７８以３∶１混合的鸡尾酒式抗体制剂，命名ＨＡＭａｘ↑［ＴＭＭ］。利用其高度中和甲肝病毒感染的功能特性和与天然抗体分子类似的全抗体分子结构特征，可望在临床上替代血制品丙种球蛋白而用于预防和治疗由甲肝病毒感染引起的甲型肝炎。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程和生物制药

技术介绍
本专利技术包括两株人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体。分别由中国 鼠卵巢细胞(CHO)生产细胞系生产。其抗体及其制剂可用于制备诊断、预防和治疗由甲型肝炎病毒感染引起的甲型肝炎的药物或试剂。 传染病所致死亡病例数在全世界死亡人口中仍占首位，而病毒性肝炎是严重危害我国人民健康的传染病。在法定报告的传染病中，各种肝炎病毒引起的急、慢性肝炎在我国所有传染病中发病率和死亡率均占首位。甲型肝炎(甲肝)是由甲肝病毒引起的急性传染病，感染对象以青少年及儿童为主，成年人发病率也呈上升趋势，它是各种病毒性肝炎中发病率最高的一种，每年发生的急性病毒性肝炎中，约有50％为甲型肝炎。我国是甲肝流行最严重的国家之一，虽然甲肝疫苗的使用已经降低了甲肝的发病率，但每年在我国局部地区仍有一定规模的爆发流行，而一旦发生传染病爆发流行，特异性抗体制剂的防御和治疗将比疫苗更迅速有效。 至今为止，大多数病毒性疾病无特异性治疗药物，用于临床治疗和预防某些病毒性疾病的生物制品仍然以血制品为主，如多年来临床上使用的血源性丙种球蛋白，用于甲肝或乙肝病毒引起的病毒性肝炎以及麻疹等预防，这些血制品中不仅非特异性杂蛋白多，特异性抗体含量很低，而且最大的问题是血源制品潜在的未能检出的病源污染问题，从长远利益考虑应当摒弃。作为一类新兴起的生物工程药，人源抗病毒基因工程抗体以其对人体无免疫原性，无污染源，特异性抗病毒疗效及连续规模生产可行性等优势逐渐成为预防和治疗病毒性疾病的一类有实际运用前景的新产品。目前美国FDA批准上市或待批的生物制品中，各种形式的单克隆抗体和基因工程抗体占到一定比例，目前已批准上市的67种生物制品中，治疗和预防用单克隆抗体和基因工程抗体共有9种。正在待批中的抗体有35种。其中已批准上市并且产生巨大经济和社会效益的四种人源化基因工程抗体中，其中有一种即为抗病毒基因工程抗体，其商品名为“SynagisTM″，为人源化抗呼吸道合胞病毒(RSV)基因工程抗体。 因此以人源基因工程产品替代血制品已成为国内外研究的一大方向，并正在逐步走向成功。用纯鼠源单克隆抗体预防和治疗病毒性疾病在国际上尚无任何批准的先例，鼠源抗体人用最大的不利之处为异源蛋白，在人体内易引起遗传免疫排斥而使抗体失效并引起免疫性疾病。因此，特异性抗病毒人源中和性抗体是病毒性疾病预防和治疗的最有前景的生物制品之一。抗甲肝抗体制剂研制成功，将为国内外首创，有可能获一类新药证书。
技术实现思路
本专利技术的目的是将已获得的中和性抗甲肝病毒Fab抗体基因(详见专利公开号为CN1316437A的专利申请)与人源IgG恒定区基因重组，通过哺乳类细胞表达系统，在哺乳类细胞CHO细胞中生产针对甲肝病毒的具有明显中和功能的分泌型完全人源IgG抗体，为将来取代目前市场上的血源性丙种球蛋白，研究开发新的临床抗病毒预防和治疗用特异性抗体药物提供可行性研究。 本专利技术包括以CHO生产细胞系生产的两株人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体及其抗体制剂，陈述如下1.人源抗甲肝病毒基因工程抗体，其特征在于1)为来源于噬菌体人源抗体库筛选的与人源IgGFc基因重组后在CHO稳定表达细胞的全人源IgG1λ全抗体，它由两条重链和两条λ-κ嵌合轻链组成，分子量为150kD左右，命名ChHAIgG16；2)为来源于噬菌体人源抗体库筛选的与人源IgGFc基因重组后在CHO稳定表达细胞的全人源IgG1κ全抗体，它由两条重链和两条κ轻链组成，分子量为150kD左右，命名ChHAIgG78；3)人源抗甲肝病毒基因工程抗体ChHAIgG16或ChHAIgG78，其可变区基因组成特征为特异性的轻链和重链基因，来源于对人源抗甲肝病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列，其中ChHAIgG16轻链和重链可变区基因序列已在专利公开号为CN1316437A专利申请中陈述；ChHAIgG78轻链可变区CDR1，CDR2和CDR3序列为分别“RASQSVSSSYLA”，“GASSRAT”和“QQYGSSPLT”；HAV78IgG重链可变区CDR1，CDR2和CDR3序列为分别“SHEMN”，“YIGSRGSDTSYADSVKGR”和“ERYRYFEDYYHGLDV”，其基因特征决定了其对甲肝病毒的亲和力和中和保护功能；4)人源抗甲肝病毒基因工程抗体ChHAIgG16或ChHAIgG78，其轻重链先导序列和恒定区基因来源于哺乳类细胞人源抗体高效表达载体VH-dhfr1和VK-dhfr1，该载体已在专利公开号为CN1363682专利申请中陈述；5)是通过哺乳类细胞表达载体系统，在CHO工程细胞系中生产的特异性结合和识别甲肝病毒外壳蛋白的高亲和力中和性人源完全抗体，具有与天然抗体分子类似的全抗体分子结构特征；其结合甲肝病毒外壳蛋白和中和病毒感染的功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。 2.用于生产人源抗甲肝病毒基因工程抗体的CHO工程细胞系的特征在于1)为稳定高效表达人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体ChHAIgG16的CHO工程细胞系；2)为稳定高效表达人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体ChHAIgG78的CHO工程细胞系；3)可被放大规模生产，其生产的抗体为分泌型抗体，可从培养上清中获得；4)经无血清细胞培养后，可通过亲和层析过程从其培养上清中经纯化而获得抗体蛋白。 3.人源抗甲肝病毒基因工程抗体制剂HAMaxTM，其特征在于为包含ChHAIgG16和ChHAIgG78两种抗体中的一种抗体单一的或两种混合的静脉注射用、肌肉注射用、口服或外用的抗体制剂；其对甲肝病毒抗原具有很高的亲和力，并具有在体外完全中和甲肝病毒和体内完全保护猴子抵御甲肝病毒攻击。 4.CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体极其抗体制剂HAMaxTM的用途，其特征在于1)可用于预防或治疗由甲肝病毒引起的甲型肝炎药物的制备；2)可用于诊断甲肝病毒感染的试剂的制备；3)可用于预防和治疗由甲肝病毒感染引起的甲型肝炎的静脉注射用、肌肉注射用、口服或外用的生物制剂的制备。 总而言之，本专利技术陈述的人源抗甲肝病毒中和性基因工程全抗体，是在获得抗体基因的基础上获得全抗体基因产物的表达，此抗体基因可随着质粒DNA在细菌内的复制而稳定复制，并已被重组到CHO细胞DNA中，形成稳定表达细胞系。利用此稳定表达细胞系，可在CHO细胞中连续规模生产抗甲肝病毒全抗体，所述抗体具有识别甲肝病毒核壳蛋白上中和抗原，从而阻断甲肝病毒感染的功能，利用其高度中和甲肝病毒感染的功能特性和与天然抗体分子类似的全抗体分子结构特征，制备抗体制剂，可望在临床上替代目前市场上的血制品丙种球蛋白而用于预防和治疗由甲肝病毒感染引起的甲型肝炎。 四、附图说明 1.图1为ChHAIgG78轻重链可变区由核甘酸序列推导的氨基酸序列，包括抗体可变区的框架区(FR)和高变区(CDR)。 2.图2为用FITC标记的抗人IgGK链(2A)和抗人IgGFc(2B)荧光抗体染色的第30代ChHAIgG16CHO细胞表达人本文档来自技高网...

【技术保护点】
人源抗甲肝病毒基因工程抗体，其特征在于：１）为来源于噬菌体人源抗体库筛选的与人源ＩｇＧＦｃ基因重组后在ＣＨＯ稳定表达细胞的全人源ＩｇＧ１λ全抗体，它由两条重链和两条λ－κ嵌合轻链组成，分子量为１５０ｋＤ左右，命名ＣｈＨＡＩｇＧ１６； ２）为来源于噬菌体人源抗体库筛选的与人源ＩｇＧＦｃ基因重组后在ＣＨＯ稳定表达细胞的全人源ＩｇＧ１κ全抗体，它由两条重链和两条κ轻链组成，分子量为１５０ｋＤ左右，命名ＣｈＨＡＩｇＧ７８；３）人源抗甲肝病毒基因工程抗体ＣｈＨＡＩ ｇＧ１６或ＣｈＨＡＩｇＧ７８，其可变区基因组成特征为特异性的轻链和重链基因，来源于对人源抗甲肝病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其相应的三个ＣＤＲ区序列为本抗体特有的全新序列，其中ＣｈＨＡＩｇＧ１６轻链和重链可变区基因序列已在专利公开号为ＣＮ１３１６４３７Ａ专利申请中陈述；ＣｈＨＡＩｇＧ７８轻链可变区ＣＤＲ１，ＣＤＲ２和ＣＤＲ３序列为分别“ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ”，“ＧＡＳＳＲＡＴ”和“ＱＱＹＧＳＳＰＬＴ”；ＨＡＶ７８ＩｇＧ重链可变区ＣＤＲ１，ＣＤＲ２和ＣＤＲ３序列为分别“ＳＨＥＭＮ”，“ＹＩＧＳＲＧＳＤＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲ”和“ＥＲＹＲＹＦＥＤＹＹＨＧＬＤＶ”；其基因特征决定了其对甲肝病毒的亲和力和中和保护功能；４）人源抗甲肝病毒基因工程抗体ＣｈＨＡＩｇＧ１６或ＣｈＨＡＩｇＧ７８，其轻重链先导序列 和恒定区基因来源于哺乳类细胞人源抗体高效表达载体ＶＨ－ｄｈｆｒ１和ＶＫ－ｄｈｆｒ１，该载体已在专利公开号为ＣＮ１３６３６８２专利申请中陈述；５）是通过哺乳类细胞表达载体系统，在ＣＨＯ工程细胞系中生产的特异性结合和识别甲肝病毒外壳蛋白 的高亲和力中和性人源完全抗体，具有与天然抗体分子类似的全抗体分子结构特征；其结合甲肝病毒外壳蛋白和中和病毒感染的功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２和ＣＤＲ３中特异性核苷酸序列决定，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。...

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁米芳，曹经媛，李川，李德新，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]