本发明专利技术公开了一种双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测鸭甲肝病毒的试剂盒及方法，所述试剂盒中应用的引物对和探针包括检测1型鸭甲肝病毒VP0基因和3型鸭甲肝病毒VP3基因的引物对和探针。对样品RNA进行RT-PCR扩增后通过FQ-PCR仪自带软件自动分析读取结果，判断样品是否含1型和3型鸭甲肝病毒：若出现Ct<35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含1型和/或3型鸭甲肝病毒；若未出现Ct<35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则样品中不含1型和/或3型鸭甲肝病毒；采用本发明专利技术检测1型和3型鸭甲肝病毒，可实现同管2种病毒同步检测，检测时间短，成本低，检测结果特异，灵敏度高，结果判定简单准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测
，具体设及一种可同时检测1型和3型鸭甲肝病毒 的特异性双重巧光定量RT-PCR(rRT-PCR)试剂盒、引物对、探针及检测方法。
技术介绍
鸭病毒性肝炎是危害养鸭业的一种重要传染病，其主要致病因子是小RNA病毒， 即小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲型肝炎病毒（化ckh巧atitisAvi;rus，DHAV)。根据 全基因组序列分析，鸭甲型肝炎病毒可分为3个独立的基因型，基因A型鸭甲型肝炎病毒 值HAV-A)、基因B型鸭甲型肝炎病毒值HAV-B)和基因C型鸭甲型肝炎病毒值HAV-C);根据 血清学中和实验，运3个基因型无血清交叉，故分别对应3个不同的血清型，血清1型鸭甲 肝病毒值HAV-1)、血清2型鸭甲肝病毒值HAV-2)和血清3型鸭甲肝病毒值HAV-3)。其中， DHAV-A代表传统的流行毒株，全国范围内广泛流行，也是我国鸭甲肝病毒的主要流行毒株， DHAV-B代表台湾新型病毒株，DHAV-C代表近年来我国和韩国等国家和地区新出现的流行 毒株。由于3个基因型病毒所引起的疾病在临床症状、病理变化上较为相似，给鉴别带来很 大困难，而大陆主要流行DHAV-1型和DHAV-3型，所W对于DHAV-1和DHAV-3的快速准确检 测对于鸭病毒性肝炎的预防与控制具有重要意义。[000引 目前关于DHAV的检测方法，国内外报道较多的包括血清中和试验、琼脂扩散试验 和化ISA等，运些传统检测方法存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用 中具有一定的局限性，在临床上常常因为不能对其及时做出正确的诊断和有效防制而造成 巨大的经济损失。而实时巧光定量RT-PCR技术凭借其操作简单、结果直观、敏感性高、特异 性强、重复性好及病原定量等优势，近年来在动物疫病检测中得W广泛应用。因此建立和优 化巧光定量RT-PCR方法，不仅为确定鸭病毒性肝炎致病因素提供了一种鉴别检测方法，同 时也为DHAV-1和DHAV-3的流行病学调查提供了一种重要技术手段。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速简便 的检测血清1型和3型鸭甲型肝炎病毒的一步法双重巧光定量RT-PCR试剂盒及方法，所 述方法利用化qMan探针技术，不仅能够实现DHAV-1与DHAV-3的同管同步鉴别，还能对 DHAV-1和DHAV-3的核酸进行准确定量检测。 本专利技术采取的技术方案如下：[000引 1、双重化qMan巧光定量RT-PCR检测1型和3型鸭甲肝病毒的引物对、探针，所述 引物对/探针包括检测1型鸭甲肝病毒VP0基因和3型鸭甲肝病毒VP3基因的引物对/探 针；其中，引物对3和探针1用于检测1型鸭甲肝病毒VP0基因，引物对4和探针2用于检 测3型鸭甲肝病毒VP3基因；引物对3核巧酸序列如SEQIDNO. 7和SEQIDNO. 8所示， 探针1核巧酸序列如SEQIDNO. 9所示；引物对4核巧酸序列如SEQIDNO. 10和SEQID NO. 11所示，探针2核巧酸序列如SEQIDNO. 12所示。 2、含有上述引物对、探针的试剂盒。[000引优选的，所述试剂盒由W下成分组成：A液PCR扩增缓冲液（2XonestepRT-PCRBufferIII，RTEnzymeMixII，EXTaq 服DM聚合酶），20pmol/yL的引物对3,20pmol/yL的引物对4，10pmol/yL的探针1， lOpmol/yL的探针 2 ;B液DHAV-1和DHAV-3RNA模板，作为阳性对照； C液RNase化ee Water,作为反应体系调整的基础补充液及空白对照。 3、利用所述试剂盒检测1型和3型鸭甲肝病毒的方法，包括如下步骤： 提取样品RNA后，对样品RNA进行巧光定量RT-PCR检测，巧光定量RT-PCR反应体 系如下：依次加入A液（2Xonest巧RT-PCRBufferllllOyLRTEnzymeMixII0. EXTaq服DM聚合酶0. 4μL，20pmol/μL的引物对3和4各0. 8μL，lOpmol/μL的探针 1 和 2 各 0. 8μL)，B液 4μL(DHAV-1 和DHAV-3RNA模板各 2μL)，最后用C液（RNaseFree Water)补至20化；扩增参数为：42°C反转录5min，95°C变性10s;95°C变性5s，54°C退火 15s，进行45个循环；扩增过程中选择肥X和FAM双重巧光通道，并在每个循环末收集巧光 信号； 通过FQ-PCR仪自带软件自动分析读取巧光定量RT-PCR检测结果：选择肥X巧光 通道，若出现Ct<35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含1型鸭甲肝病毒，若 未出现Ct<35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含1型鸭甲肝病毒；选择 FAM通道，若出现Ct<35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含3型鸭甲肝病毒， 若未出现Ct<35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含3型鸭甲肝病毒。 本专利技术的有益效果在于：基于对DHAV-1和DHAV-3同时进行检测和诊断的目的，本 专利技术研究筛选了两套特异性的探针和引物，并通过进行不同的浓度配比，获得最佳引物和 探针的浓度组合，据此建立了DHAV-1和DHAV-3的一步法双重巧光定量RT-PCR检测方法， 并制备了相应的试剂盒。本专利技术具有如下优点： (1)测时短，操作方便简洁；应用本专利技术可实现一管同步二检的目的，并且反转录 和PCR在一个反应管中一步完成，整个过程仅需约50分钟，且检测结果可在电脑上直接读 取；而常规RT-PCR步骤繁琐耗时长，约需5小时； 似检测特异性好，灵敏度高；当DHAV-1与DHAV-3同时存在时，获得的Ct值与单 种病毒检测的Ct值比较，结果基本一样，说明两种类型病毒的检测结果间互不影响；另外， 本专利技术还可对样品中相应病原含量进行定量，并且灵敏度高，分别能检测98拷贝DHAV-1和 10拷贝DHAV-3,比常规PCR方法灵敏度高约100倍，因而可用于DHAV-1和DHAV-3致病机 理及DHAV-1疫苗评估等方面的研究。【附图说明】 为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图：[001引图1DHAV-1定量标准曲线，扩增效率为98. 0%，标准曲线相关系数R2= 0. 999， 公式：Y= -3. 371X+42. 679,表明误差小，可信度高。 图2DHAV-3定量标准曲线，扩增效率为96. 9%，标准曲线相关系数R2= 0. 998， 公式：Υ= -3. 398X+42. 858,表明误差小，可信度高。 图3巧光定量RT-PCR检测DHAV-1的敏感性试验结果，曲线1~4分别为10倍梯 度倍比稀释至浓度为4. 88X104~4. 88X10icopies/μL的标准品扩增曲线，根据扩增曲线 可看出该方法最低检测限度为49copies/μL。[002引图4巧光定量RT-PCR检测DHAV-3的敏感性试验结果，曲线1~4分别为10倍梯 度倍比稀释至浓度为4. 72X103~4. 72X10 "copies/μL的标准品扩增曲线，根据扩增曲线 可看出该方法最低检测灵敏度为5cop本文档来自技高网...
【技术保护点】
双重TaqMan荧光定量RT‑PCR检测1型和3型鸭甲肝病毒的引物对、探针，其特征在于：所述引物对、探针包括检测1型鸭甲肝病毒VP0基因和3型鸭甲肝病毒VP3基因的引物对、探针；其中，引物对3和探针1用于检测1型鸭甲肝病毒VP0基因，引物对4和探针2用于检测3型鸭甲肝病毒VP3基因；引物对3核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，探针1核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；引物对4核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，探针2核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，胡琴，汪铭书，朱德康，杨乔，贾仁勇，陈舜，孙昆峰，刘马蜂，吴英，陈孝跃，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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