本发明专利技术公开了一种1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白及其制备方法和用途，属于生物医药技术领域。一种VP0重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：a)VP0全基因的目的片段克隆及表达载体的构建；b)VP0重组蛋白的表达；c)VP0重组蛋白的纯化；本发明专利技术还对VP0重组蛋白在检测及免疫保护中的作用进行研究，为鸭病毒性肝炎的检测和防治提供一种新的途径，成功建立了基于VP0重组蛋白的间接ELISA方法，该方法具有重复性好和特异性强的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，具体设及一种1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白及其 制备方法和应用。
技术介绍
鸭肝炎又名鸭病毒性肝炎值uckviralhepatitis,DVH)，是由鸭肝炎病毒值uck hepatitisvirus,DHV)引起的一种高度接触性和致死性的鸭病毒性传染病，其特征为发 病急、传播快、病程短、病死率高，病鸭剖检可见肝肿大、表面呈树枝状充血或出血性斑点， 该病最早于1945年发现于美国。DHV最初分S个血清型值HV-1、DHV-2和DHV-3)，后来 DHV-2和DHV-3被划归星状病毒科，S个血清型之间无抗原相关性。现在DHV-1已被命名 为鸭甲型肝炎病毒值uckh巧atitisAvirus,DHAV)，归为小RNA病毒科的禽肝炎病毒属 (Avihepatovirus)，包含S个基因型值HAV-U2和3)，其中1型鸭甲肝病毒值HAV-1)是分 布最广、危害最大的鸭甲型肝炎病毒。 DHAV-1属于小RNA病毒科禽肝病毒属，病毒粒子呈球形或类球形，直径20~ 40nm。该类病毒衣壳呈二十面体对称，包含32个壳粒，没有囊膜和突起，增殖速度快，繁殖 能力强，复制一代约化。DHAV-1是单链RNA病毒，基因组RNA长度7化~8化，分子量为 8. 6Xl〇6Da，其具有较强的感染性。DHAV-1生存能力极强，它能够抵御外界环境的影响。在 不同的条件下，该病毒的生存能力不同。如自然环境下，DHAV-1能够长时间的存活并且繁 殖，阴凉环境如湿粪中可W生存37dW上，0~4°C下可存活2年W上，而-20°C下可存活长 达9年。DHAV-1能够耐受强酸，对氯仿、甲醇、乙酸等有机溶剂均不敏感，并且对常见的消毒 剂如甲醒、福尔马林等也有明显的抵抗力，对热也有一定的耐受作用。DHAV-1不凝集任何动 物的红细胞，也不吸附任何红细胞。由于DHAV-1的研究开始较晚，而小RNA病毒科的病毒 成员具有相似的基因复制、功能机制，所W，了解其他小RNA病毒的结构、基因功能等分子 生物学特性，可为DHAV-1分子结构和生物学方面的研究提供更好的思路和创新。 小RNA病毒是RNA病毒中最小的一类，分布极为广泛，可归为肠道病毒属 (enterovirus)、口疮病毒属（Aphthovirus)、屯、病毒属（Cardiovirus)、嗜肝病毒属 化epatovirus)、副肠孤病毒属（Parechovirus)、马鼻病毒属巧rbovirus)、崎病毒属 化obuvirus)、捷申病毒属（Teschovirus)、禽肝炎病毒属（Avihepatovirus)等。小RNA病 毒呈圆形，病毒粒子直径为20~40nm，无囊膜，病毒的结构蛋白（衣壳蛋白）一般包括VP1、 VP2、VP3和VP4。其中VP1、VP2、VP3暴露在病毒表面，组成一个亚单位。VP2蛋白位于衣 壳表面，含有抗原表位并且有些抗原表位可诱导机体产生中和抗体，衣壳蛋白VP2和促调 亡蛋白/调亡前体蛋白Siva间存在相互作用，柯萨基病毒B3的VP2蛋白可能特异地结合 到调亡前体蛋白Siva上，从而影响细胞调亡的诱导、病毒的扩散W及病毒导致的病理学进 程；VP4埋在病毒粒子内部，处于蛋白外壳的内部与基因组RNA相连接，VP4蛋白在生理溫 度下的向外暴露与病毒颗粒吸附细胞膜时发生的构象改变有直接的联系，在病毒毒粒吸附 细胞膜之后可能参与了病毒进入细胞过程有关的相关事件。小RNA病毒的蛋白外壳具有很 强的自身动态变化，而不是像晶体结构图所反映的那样处于一个静止状态。抗体与病毒结 构构象关系的研究对理想疫苗的设计及更好地预防小RNA病毒的传播具有重要意义。但对 DHAV衣壳蛋白的研究相对很少。生物信息学分析和推测表明，DHAV-1的衣壳蛋白可能为 VPUVP3和VPO,而不是像多数小RNA病毒那样为VP1、VP2、VP3和VP4,因此DHAV-1到底是 VPO还是VP2和VP4,他们是否位于或暴露在病毒表面目前未见报道，其抗原性的研究报道 较少。 因此针对DHAV-1VP0基因进行原核表达，并对原核表达的VP0蛋白在检测及免 疫保护中的作用进行研究，成为本领域技术人员研究的热点，现有技术中存在针对DHAV-1 VP0基因进行原核表达得到VP0蛋白的技术，但该VP0蛋白仍存在难于表达和纯化、蛋白活 性低，检测鸭病毒性肝炎抗体精度不高，检测效率低的缺点，由此可见，将DHAV-1VP0基因 的原核表达方法做进一步改进，使得到的VP0重组蛋白表达量大、纯化容易、蛋白活性好， 具有在检测鸭病毒性肝炎抗体中精度高的优点，找到鸭病毒性肝炎的检测和防治的有效途 径，成为本领域人员亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是克服现有技术中的问题，提供一种VP0重组蛋白及其制备方 法和用途。 为解决上述技术问题，采用的技术方案包括： -种1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白，其氨基酸序列如沈QIDNO: 1所示，其DNA序 列如沈QIDNO:2所示。 一种上述1型鸭甲肝病毒VPO重组蛋白的制备方法，包括如下步骤： 步骤一 ：1型鸭甲肝病毒VP0全基因的克隆：分析确定1型鸭甲肝病毒VP0全基因 及酶切位点，根据Genbank登录号为JQ316452. 1的DHAV-1X株全基因序列，设计扩增1型 鸭甲肝病毒VP0基因DNA片段的特异性引物，同时在引物的5'端添加上BamHI和化0I 两个酶切位点，提取1型鸭甲肝病毒的RNA，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，得到1型鸭 甲肝病毒VP0全基因的目的片段； 步骤二：构建重组表达载体祀T-32a(+)/VP0 :将1型鸭甲肝病毒VP0全基因的 目的片段进行T克隆得到PMD18-T/VP0,分别培养含重组质粒PMD18-T/VP0和表达质粒 祀T-32a(+)的菌株，提取质粒，并用BamHI和化0I对其进行双酶切，分析、回收、纯化 后，将得到带有粘性末端的1型鸭甲肝病毒VP0全基因的目的片段与双酶切处理过表达质 粒祀T-32a(+)进行连接，将连接产物进行转化和鉴定； 步骤S:制备1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白：将重组表达载体祀T-32a(+)/VP0转 化到Ecoli.化21表达宿主菌中，筛选，将筛选后的含重组表达载体祀T-32a(+)/VP0的菌株 经培养诱导表达，将表达产物经鉴定、纯化后，得到1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白。 进一步的，所述特异性引物为： 上游引物P1 :5 'GGATCCGAAATGGATACTCTTACCAAAAAT3，，下游引物P2 :5'CTCGAGTCCCTGATTGTCAAATGGTC3，。 进一步的，所述步骤二中1型鸭甲肝病毒VP0全基因的目的片段进行T克隆的方 法为：将所述步骤一获得的1型鸭甲肝病毒VP0全基因的目的片段进行纯化回收，纯化产物 末端加A,与PMD18-T载体连接得到连接产物，将所述连接产物转化至感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆，将得到的PMD18-T/VP0进行酶切鉴定。 进一步的，所述步骤二中的连接反应体系为，带有粘性末端的1型鸭甲肝病毒VP0 全基因的目的片段5.5yl，表达载体祀T-32a(+)2yl，2XT4DNALigaseMix7.5yl。瞬 离，混匀，16 °C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种1型鸭甲肝病毒VP0重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其DNA序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，汪铭书，齐晓燕，杨乔，陈孝跃，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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