本发明专利技术用物理化学诱变育种一种新型的能够分解多种尿毒素的乳酸工程菌，是将尿毒症患者血清作定向诱导，经双重多次诱变改变乳酸杆菌的基因而获得，可以将其制成生物制剂口服，让其定植于肠粘膜，持续分解尿毒素，用于治疗尿毒症或慢性肾功能衰竭。乳酸杆菌是人体肠道益生菌，定植于肠粘膜内层，其本身有增强免疫抑制病原菌，合成多种维生素及降胆固醇等功能。乳酸杆菌基因工程菌在降低多种尿毒素的基础上弥补了慢性肾衰患者免疫力低下、维生素缺乏和脂肪代谢紊乱的缺陷。为慢性肾衰提供一种综合治疗的生物制剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种突变的乳酸杆菌，具体涉及ー种通过人为干预手段使乳酸杆菌突变后获得的ー种基因工程菌。本专利技术还涉及该基因工程菌的制备过程。本专利技术还进ー步涉及该基因工程菌的用途。
技术介绍
慢性肾衰关键致病环节是尿毒症毒素在体内的过度潴留。而潴留于患者体内的 尿毒素主要为尿素、肌酐、尿酸，其他毒素多为由此三种转化，衍生、结合的产物，如尿素可衍生为胍类和氨基甲酰化合物，肌酐可衍变为氢氧化肌酐和甲基胍。三种毒素及其衍生物在尿毒症患者体内蓄积，可导致心肌损伤，肾小球功能进行性丧失，血小板功能障碍，高血压，神经系统损害以及甲状腺功能紊乱等，是引起尿毒症症状，导致机体内环境紊乱，器官损害包括肾功能进行性恶化、判断透析疗效及病人预后的主要物质。因此，清除这些尿毒素对于慢性肾衰的治疗是十分重要的。目前，慢性肾衰仍缺乏满意的治疗，主要靠血透、腹透和肾移植治疗。但这些治疗均存在其固有的弊端。由于经济费用高，耗时长，操作复杂，全世界仅有15%的肾衰患者可以接受透析治疗，某些尿毒素在血液中与白蛋白结合，血透难以将其清除，如硫酸吲哚酚和同型半胱氨酸，它们能刺激血管平滑肌细胞増殖，減少肾脏清除超氧化物质，不仅加重残余肾衰竭而且是并发心血管病变的主要危险因素。且血透并发症较多，在美国大约每年有80000肾衰患者死于透析相关的各种并发症。肾移植供求矛盾尖鋭，在美国肾源和需要移植的比例为I : 8，接受透析的病人中，因存在至今尚未突破的医疗难题，透析患者中约有50%在3年内死亡。由于在我国大部份地区仍处于发展中甚至贫困状态，能接受透析和肾移植的CRF患者仅达15%，而85%的CRF患者得不到有效的救治。而另ー类不可忽视的状况是已出现肾功能不全但未达到透析标准的病人比需要透析病人多5-10倍。而对于这一部分病人的治疗，疗效被公认的是用血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotension converting enzyme inhibitors, ACEI)和血管紧张素 II 受体拮抗剂(Angiotensin II receptor antagonists, ARB),这两类药主要通过降低肾小球内高压力，高灌注和高滤过，延缓肾功能恶化，但忽略了已积聚在体内的代谢产物对包括肾脏在内的所有组织细胞的损害和功能恶化。因而探索一种经济、创伤小的慢性肾衰替代治疗显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的g在提供一种能表达多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌，能使之应用于持续分解多种尿毒素，从而提供一种能用于治疗慢性肾脏衰竭、尿毒症等疾病的药物。本专利技术提供了具有保藏号为CCTCC NO M2011171的基因工程乳酸杆菌。其保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学(邮编430072)。保藏菌种的分类命名为保加利亚乳杆菌突变株25号(Lactobacillus bulgaricusmutant 25号)。保藏日期为2011年5月17日。本专利技术提供的基因工程乳酸杆菌是可以用保加利亚乳酸杆菌经尿毒症患者血清定向诱导后，再经紫外线和硫酸ニこ酯双重多次诱变后，通过尿毒素筛选平板反复筛选获得。ー种产多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌的制备方法如下运用尿毒症患者血清定向诱导原始保加利亚乳杆菌(L. Bulgaria，L. B)，使其对各种尿毒素均具有一定的降解能力(见图I)。以定向诱导后分解能力最強的L.B诱导株为出发菌株，运用紫外线(UltraViolet, UV)及硫酸ニこ酯(Diethylsulfate, DES)对其进行双重多次诱变，在尿毒素筛选培养基中筛选出具有高效分解尿毒素能力的L. B突变株(见图2)。 所述的定向诱导方法为使L. B在尿毒症患者血清中连续培养25代。所述的双重多次诱变的具体方案见图14 :UV诱变的条件为取细菌对数生长期的中后期14—16h为诱变的时间点，细菌浓度为I. 5X108cfu/ml为诱变浓度，30W紫外灯，照射距离30cm，照射时间为15s进行诱变。DES诱变条件为取细菌对数生长期的中后期12—14h为诱变的时间点，细菌浓度1.5X108cfu/ml为诱变浓度，DES浓度为1%，处理时间为20min进行诱变。所述的初筛平板I为尿毒素浓度梯度MRS培养基，其具体配制方法为先倒入普通MRS琼脂培养基，倾斜培养皿约15°，待凝固后平放，再倒入含20% (v/v)尿毒症患者血清的MRS琼脂培养基。冷却凝固后，倒置于4°C贮存。所述的初筛平板2为尿毒素为唯一氮源培养基，其具体配制方法为葡萄糖20g，こ酸钠 5. 0g，柠檬酸ニ铵 2. Og,吐温 801ml, MgSO4 · 7H20 O. 2g，MnSO4 · 4H20 0. 05g, K2HPO42.0g，琼脂15g，调pH值到6. 12 6. 2，蒸馏水定容至I. 0L, 115°C高压灭菌20min。待液体冷却到45°C左右，加入过滤除菌的尿毒症患者血清，使其终浓度为20% (v/v)，再铺平板。冷却凝固后，倒置于4°C贮存。所述的复筛培养基为尿毒症患者血清。本专利技术提供的产多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌的具体制备步骤如下I、产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌的定向诱导将活化的L. B以4% (v/v)接种于尿毒症患者血清中，振荡混匀后厌氧培养24小时,为第I代。混匀后取1%置于新的尿毒症患者血清中，振荡混匀后37°C厌氧培养24h，为第2代。如此反复传代至25代后取出检测该菌分解尿毒素的能力。2、产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌的双重多次诱变选择定向诱导后，分解尿毒素能力最強的L. B诱导株作为出发菌株，根据前述的诱变方案进行双重多次诱变。取细菌对数生长期的中后期(16小吋)为诱变的时间点，细菌浓度为1.5X108cfu/ml，30W紫外灯，照射距离30cm，照射时间为15s进行紫外线诱变，反复诱变3次后，涂布初筛平板I和2。分别挑取尿毒素筛选平板I上尿毒素浓度高的部位、生长直径较大的菌落以及尿毒素筛选平板2上生长良好的菌落400株接种于尿毒症患者血清中培养24h，每株I管，检测培养前后，血清中尿毒素的浓度，计算尿毒素转化率。挑选出尿毒素转化率较出发菌株提高大于5%的菌株50株，接种于尿毒症患者血清中培养24h，每株4管，检测培养前后,血清中尿毒素的浓度,计算尿毒素转化率。选择尿毒素转化率最高的一株作为进ー步DES诱变的出发菌株。取细菌对数生长期的中后期(14h)为诱变的时间点，细菌浓度为I. 5X108cfu/ml，DES浓度为I %，处理时间为20min进行DES诱变。反复诱变3次后，涂布初筛平板I和2。分别挑取尿毒素筛选平板I上尿毒素浓度高的部位、生长直径较大的菌落以及尿毒素筛选平板2上生长良好的菌落400株接种于尿毒症患者血清中培养24h，每株I管，检测培养前后，血清中尿毒素的浓度，计算尿毒素转化率。挑选出尿毒素转化率较出发菌株提高大于5%的菌株50株，接种于尿毒症患者血清中培养24h，每株4管，检测培养前后，血清中尿毒素的浓度，计算尿毒素转化率。选择尿毒素转化率最高的一株为我们的目的菌株。目的菌株降解尿毒素的能力较非诱变L.B显著提高，高浓度尿毒素血清中可以持 续分解多种尿毒素。本申请人还发现，本专利技术提供的乳酸杆菌，与非变异的乳酸杆菌一祥，可以本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因工程乳酸杆菌，具有保藏号为：CCTCC？NO：M2011171。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋云生，王芳，向大雄，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：
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