一株高产天然虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法和应用技术

本发明专利技术公开了一株高产天然虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法和应用，该菌株命名为红法夫酵母(Phaffia?rhodozyma)CZ10，保藏号为CGMCC?No.6355。通过如下方法选育：选取亲本菌株，分为两组，分别进行LiCl-紫外复合诱变和60Co-γ射线诱变，筛选后若干株诱变株I和若干诱变株II；将诱变株I和诱变株II进行原生质体融合、再生和筛选，得到若干株虾青素产量高于诱变株I和诱变株II的融合菌株；将步骤(2)所得的融合菌株进行递归式原生质体融合，至少进行5轮，得到所述的红法夫酵母菌株。本发明专利技术的菌株应用于工业上生产虾青素，其虾青素产量达到68mg/L，相对选育前的亲本菌株提高了14.3倍。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物发酵工程
，具体涉及ー株高产天然虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法和应用。
技术介绍
虾青素(3，3' -ニ羟基-4，4' ニ酮基-β，β'胡萝卜素)是ー种酮式类胡萝卜素，天然呈红色。虾青素最初被用做水产业的饲料添加剤，后来药理学和生理学研究表明虾青素有极强的抗氧化、淬灭自由基的功能，井能促进抗体的产生，增强宿主的免疫功能，在食品、医药和化妆品等领域有广阔的应用前景，具有很高的经济价值。 红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)是卩隹一天然可产奸青素的酵母,其反式奸青素已于2000年获得FDA批准，用于食品添加剤。它是真菌界、真菌门、半知菌亚门、隐球酵母科、红法夫酵母属的唯一种。作为虾青素的生产菌，红法夫酵母具有许多优势可利用多种糖进行快速异养代谢，培养时间短，不需光照及可以实现高密度培养等。但野生型红法夫酵母(DCW)的虾青素含量低(300 450 μ g/g干细胞)，发酵成本高，无法与化学合成竞争，无法满足エ业化生产，因此需要对虾青素产菌株进行选育和改良，以提高产品质量，降低成本。由于红法夫酵母的遗传背景并不清楚，虾青素的合成路径也很复杂。因此，目前多采用传统的诱变和原生质体融合等方法对其进行改造。申请号为200910188300. 6的中国专利技术专利文献公开ー种红法夫酵母菌株的复合诱变方法，首先将红法夫酵母菌株进行两次紫外诱变，得到一株五代内遗传性状稳定的突变株，然后又将此突变株低温处理，经低温处理的突变株，又经过单线态氧诱变处理，得到一株在10代内有良好遗传稳定性的突变株，将突变株进行发酵培养，測定器生物量和色素含量，均高于原始菌株。申请号为91105886. 9的专利文献公开了ー种红法夫酵母细胞的球状体融合技术及由球状体融合得到的几株新的红法夫酵母菌株，比亲本菌株的虾青素产量闻。但是诱变育种具有盲目性、随机性，导致工程量巨大，时间漫长，菌株突变面临回复现象的难题。原生质体融合技术可以扮演类似于有性生殖途径基因信息交流的作用，但是有性生殖途径只能允许在双亲本之间的基因重组。因此，寻找ー种简单、高效的育种方法尤为重要。目前，国外已有利用红法夫酵母进行虾青素生产的企业，如美国的红星公司、Igene生物有限公司、Tate&Lyle发酵产品有限公司和Igene生物技术有限公司合资エ厂等。但国内还没有虾青素的生产企业，因此研究一种适于エ业生产的虾青素生产途径具有很好的研究意义和很大的发展空间。
技术实现思路
本专利技术提供了一株高产天然虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法和应用。以红法夫酵母为亲本菌株，采用基因组重排技术，选育出一株高产虾青素的红法夫酵母菌株，无需了解其基因组学、代谢组学等具体背景，操作简单，见效快，适于エ业生产。一株红法夫酵母菌株,命名为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZ10,保藏号为CGMCC No. 6355。本专利技术所选育出的红法夫酵母菌株于2012 年7月12日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,命名为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)CZ10，保藏号为CGMCC No. 6355。本专利技术还提供了ー种利用所述的红法夫酵母菌株生产虾青素的方法，包括将所述的红法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO接种到发酵培养基中进行发酵培养,发酵完成后，提取所述虾青素。所述的发酵培养基(g/L) :10. O葡萄糖，5. O蛋白胨，5. O浓缩酵母浸出粉，0.2CaCl2 · 2H20, 2. 75MgS04 · 7H20,1. 5KH2P04, 3. 0 (NH4)2S04, pH 5. 0所述发酵条件为22±1で，1501'/11^11，培养48-7211。虾青素提取的方法有很多种，本专利技术中所述提取虾青素的方法为取发酵液，第一次离心、收集菌体，将菌体破碎，萃取、第二次离心，获得虾青素。优选地，所述萃取采用的萃取剂为丙酮；所述第二次离心的转速为4500 5000r/m ;所述菌体破碎的方法为将所述菌体悬浮在预热后的ニ甲基亚砜中，振荡。具体操作步骤为取5mL发酵液于5000r/m下离心IOmin,去离子水洗漆两次，收集菌体，加入ImL 55°C预热的ニ甲基亚砜(DMSO)，振荡悬浮，加入丙酮4mL，漩涡震荡20_30s, 4°C, 5000r/m 离心 IOmin 去沉淀。采用紫外分光光度方法检测虾青素的产量，本专利技术选育出的红法夫酵母菌株发酵产生虾青素，其虾青素的产量可达到68mg/L。本专利技术还提供了一种所述的红法夫酵母菌株的选育方法，包括(I)选取亲本菌株，分为两组，分别进行LiCl-紫外复合诱变和6tlCo-Y射线诱变，筛选后分别得到经LiCl-紫外复合诱变的若干株诱变株I和经6tlCo- Y射线诱变的若干诱变株II。所述的LiCl-紫外复合诱变的条件为菌悬液中加入10% LiCl溶液，30cm、15W紫外灯照射。所述的菌悬液浓度为IO6个/mL，所述的LiCl溶液与菌悬液的体积比为3 50。具体操作过程为将亲本菌株用无菌生理盐水配制成菌悬液，菌悬液用无菌生理盐水稀释至一定浓度，优选为IO6个/mL,然后取5ml菌悬液于带磁力转子的培养皿中,加入300 μ L 10% LiCl混匀后开盖进行紫外线照射。诱变条件30cm，15W紫外灯。照射7min，黑暗处理后适当稀释涂板，在22°C恒温培养箱中暗培养4-6d。同时，以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率。致死率的计算方法如下未经诱变平板上的菌落数-经诱变后平板上的菌落数 未经诱变平板上的菌落数060Co-Y射线诱变可采用现有技术中常规的方法，本专利技术中送至浙江省农科院钴室进行诱变，诱变的条件为菌悬液浓度为IO6个/mL，诱变剂量为3500Gy。(2)将所述的诱变株I和诱变株II进行原生质体融合、再生和筛选，得到若干株虾青素产量高于诱变株I和诱变株II的F-I代融合菌株。(3)将步骤(2)所得的F-I融合菌株进行递归式原生质体融合，至少进行5轮，得到所述的红法夫酵母菌株。递归式原生质体融合(recursive protoplast fusion),也称多轮循环原生质体融合技术，即将各种亲本制成原生质体-融合-再生-再制成原生质体-融合-再生的技木。本专利技术中通过LiCl-紫外复合诱变和6tlCo-Y射线诱变分别筛选出其虾青素产量高于亲本菌株的诱变株。将上述分别经过LiCl-紫外复合诱变和6ciCo-Y射线诱变的诱变株脱去细胞壁，进行原生质体融合、再生，得到第一轮融合后的融合菌株。通过现有技术中常规的筛选方法筛选出虾青素产量高于所述诱变株的融合菌株进入下ー轮融合，每ー轮融合结束后筛选出虾青素产量高于该轮融合的亲本菌株的融合菌株进入下ー轮融合，如此进行递归式原生质体融合，至少进行5轮，得到所述的红法夫酵母菌株。 所述的筛选为采用含不同浓度梯度的YM- ニ苯胺筛选培养基进行筛选。本专利技术所需的亲本菌株，没有特别的要求，一般可获得的红法夫酵母菌株都可以，优选的亲本菌株为红发夫酵母(Phaffia rhodozyma) 02,其来源为浙江エ商大学食品与生物工程学院保藏，由梁新乐(浙江杭州)赠送。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株红法夫酵母菌株，其特征在于，命名为红法夫酵母(Phaffia？rhodozyma)CZ10，保藏号为CGMCC？No.6355。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡向东，朱静，梁新乐，
申请(专利权)人：浙江皇冠科技有限公司，
类型：发明
国别省市：