表达外源蛋白的毕赤酵母、其构建方法及其诱导表达方法技术

本发明专利技术提供了表达外源蛋白的毕赤酵母菌株及表达系统，该毕赤酵母菌株的GTP1基因发生突变，突变后的毕赤酵母基因不能编码甘油转运蛋白或编码的甘油转运蛋白没有活性，能够在甘油存在条件下启动PAOX1的转录，从而提高毕赤酵母在甘油存在条件下AOX1的表达量，从而提高外源蛋白的表达量。同时，本发明专利技术还提供了所述表达外源蛋白的毕赤酵母的构建方法，所述表达外源蛋白的毕赤酵母的诱导表达方法，该诱导表达方法能够有效提高外源蛋白表达量及最终细胞浓度。

【技术实现步骤摘要】
表达外源蛋白的毕赤酵母、其构建方法及其诱导表达方法
本专利技术涉及发酵工程和生物工程
，具体涉及表达外源蛋白的毕赤酵母、其构建方法及其诱导表达方法。
技术介绍
毕赤酵母表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统，相对于大肠杆菌表达系统而言，毕赤酵母表达系统具有明显的优越性，诸如：倍增时较短，发酵周期短；基因组简单，便于操作；培养条件相对简单，且易于进行高密度培养，进而可以获得较高的目的蛋白产量；对外源蛋白可以进行折叠、糖基化修饰，形成二硫键等；同时，它还避免了酿酒酵母分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷；并且，就糖基化程度而言，毕赤酵母中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为8-14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50-150甘露糖残基要短得多，不会产生过度糖基化现象；此外，毕赤酵母其自身分泌的胞外蛋白很少，这对于后期的蛋白纯化非常有利。自20世纪80年代起建立的以毕赤酵母作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟，干细胞产量可高达100g/L。种种优势使毕赤酵母成为近年来极受青睐的真核基因表达系统宿主。已用该系统成功表达了数百种来自病毒、细菌、真菌、动植物和人的蛋白，如人白介素、人血清白蛋白、肿瘤坏死因子、乙肝表面抗原、水蛭素衍生物等。毕赤酵母是目前应用最广泛的外源蛋白真核表达系统之一，该系统基于一个高效的醇氧化酶1(alcoholoxidase1,AOX1)启动子(AOX1promoter,PAOX1)，PAOX1的转录只响应甲醇的诱导，当以甲醇为唯一碳源时，PAOX1启动外源蛋白的表达；而当甘油存在时，抑制AOX1的表达。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了表达外源蛋白的毕赤酵母，其能解决现有技术中毕赤酵母在甘油诱导条件下AOX1表达量低的技术问题；此外，本专利技术还提供了该毕赤酵母的构建方法和诱导表达方法。本专利技术提供一种突变的毕赤酵母GTP1基因，其特征在于，所述突变导致毕赤酵母不能编码甘油转运蛋白或编码的甘油转运蛋白没有活性，并能够在甘油存在条件下启动PAOX1的转录。所述GTP1基因序列如SEQIDNO.1所示，编码氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。进一步地，所述突变为全部或部分序列缺失突变、插入突变、移码突变或点突变。进一步地，所述的缺失突变为缺失GTP1基因的整个开放阅读框或者部分序列突变。所述的GTP1体外缺失片段序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还提供了包含所述突变基因的重组载体。包含重组载体的宿主细胞。本专利技术还提供了一种表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株含有权利要求1-5任意一项所述的突变的毕赤酵母GTP1基因。进一步地，所述毕赤酵母菌株是由酵母菌株X-33突变GTP1基因所得。进一步地，所述毕赤酵母菌株于2016年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.12718。同时，本专利技术还提供了一种表达外源蛋白的毕赤酵母菌株表达系统，其特征在于，所述系统包括(1)权利要求1中所述的毕赤酵母菌株CGMCCNo.12718，(2)含有启动子为PAOX1的外源蛋白表达载体；(3)碳源。进一步地，所述毕赤酵母菌株的GTP1基因发生突变，GTP1基因序列如SEQIDNO.1所示，使得突变后的毕赤酵母基因不能编码甘油转运蛋白或编码的甘油转运蛋白没有活性。进一步地，所述碳源为甘油、甲醇或甘油与甲醇的混合物。诱导所述毕赤酵母表达外源蛋白的碳源为甘油，所述甘油添加后的体积浓度B2的范围为0<B2≤0.5％。诱导所述毕赤酵母表达外源蛋白的碳源为甲醇，所述甲醇添加后的体积浓度A1的范围为0<A1≤2％。诱导所述毕赤酵母表达外源蛋白的碳源为甲醇与甘油的混合物，所述甲醇添加后的体积浓度A2的范围为0<A2≤2％，所述甘油添加后的体积浓度B1的范围为0<B1≤0.5％。进一步优选为，所述甲醇添加后的体积浓度A2为1％，所述甘油添加后的体积浓度B1为0.25％。此外，本专利技术还提供了一种表达外源蛋白的毕赤酵母的诱导表达方法，其包括以下步骤，步骤1，将含有启动子为PAOX1的外源蛋白表达载体转化至毕赤酵母中，所述毕赤酵母含有突变的毕赤酵母GTP1基因；步骤2，将步骤1得到的毕赤酵母接种于培养基中培养；步骤3，离心步骤2中获得的毕赤酵母菌，并重新培养至含有碳源的培养基中培养。其中，所述GTP1基因序列如SEQIDNO.1所示，编码氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。所述突变为全部或部分序列缺失突变、插入突变、移码突变或点突变。所述的缺失突变为缺失GTP1基因的整个开放阅读框或者部分序列突变。所述的GTP1体外缺失片段序列如SEQIDNO:3所示。其中，步骤2中所述培养基为YPD液体培养基，于30℃、230r/min培养至OD600为2～6。其中，所述碳源为甘油、甲醇或甘油与甲醇的混合物。诱导所述毕赤酵母表达外源蛋白的碳源为甘油，所述甘油添加后的体积浓度B2的范围为0<B2≤0.5％。诱导所述毕赤酵母表达外源蛋白的碳源为甲醇，所述甲醇添加后的体积浓度A1的范围为0<A1≤2％。诱导所述毕赤酵母表达外源蛋白的碳源为甲醇与甘油的混合物，所述甲醇添加后的体积浓度A2的范围为0<A2≤2％，所述甘油添加后的体积浓度B1的范围为0<B1≤0.5％。优选为，所述甲醇添加后的体积浓度A2为1％，所述甘油添加后的体积浓度B1为0.25％。其中，所述碳源的添加方式为，以体积浓度计，0～24h，向液体培养基中添加1％甘油；24h～48h，向液体培养基中添加1％甲醇；48h～72h，向液体培养基中添加1％甲醇和0.25％甘油；72h～96h，向液体培养基中添加1％甲醇和0.25％甘油。此外，本专利技术还提供了表达外源蛋白的毕赤酵母的构建方法，其包括以下步骤：步骤1，体外构建发生突变的GTP1基因片段，发生突变的GTP1基因片段不能编码甘油转运蛋白或编码的甘油转运蛋白没有活性；步骤2，将步骤1中得到的发生突变的GTP1基因片段转化至酵母菌中；步骤3，对步骤2获得的酵母菌进行筛选，获得GTP1基因发生突变的酵母株；步骤4，对步骤3获得的酵母菌进行筛选，获得在甘油或甲醇、甘油混合条件下诱导具有AOX1酶活性的毕赤酵母株。进一步地，所述毕赤酵母菌株的GTP1基因序列如SEQIDNO.1所示，编码氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。所述毕赤酵母菌株的GTP1基因发生的突变为缺失突变、插入突变、移码突变或点突变。优选为，所述毕赤酵母菌株的GTP1基因发生的突变为缺失突变。进一步地，所述的缺失突变为缺失GTP1基因的整个开放阅读框或部分序列，GTP1体外缺失片段序列如SEQIDNO:3所示。采用本专利技术后，通过对毕赤酵母的GTP1基因发生突变，使得突变后的毕赤酵母基因不能编码甘油转运蛋白或编码的甘油转运蛋白没有活性，并经实验证明经突变GTP1基因后的毕赤酵母能够在甘油或者甘油、甲醇混合培养基中诱导PAOX1的转录，进而使得外源蛋白得以表达。同时，采用本专利技术连续添加碳源的培养方式，使ΔGTP1-EGFP在最终收获时，细胞浓度高而且诱导表达的EGFP量高。需要说明的是，本专利技术所涉及的毕赤酵母为巴斯德毕本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变的毕赤酵母GTP1基因，其特征在于，所述突变导致毕赤酵母不能编码甘油转运蛋白或编码的甘油转运蛋白没有活性，并能够在甘油存在条件下启动PAOX1的转录。

【技术特征摘要】
1.一种突变的毕赤酵母GTP1基因，其特征在于，所述突变导致毕赤酵母不能编码甘油转运蛋白或编码的甘油转运蛋白没有活性，并能够在甘油存在条件下启动PAOX1的转录。2.根据权利要求1所述的突变的毕赤酵母GTP1基因，其特征在于，所述GTP1基因序列如SEQIDNO.1所示，编码氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.根据权利要求2所述的突变的毕赤酵母GTP1基因，其特征在于，所述突变为全部或部分序列缺失突变、插入突变、移码突变或点突变。4.根据权利要求3所述的突变的毕赤酵母GTP1基因，其特征在于，所述的缺失突变为缺失GTP1基因的整个开放阅读框或者部分序列突变。5.根据权利要求4所述的突变的毕赤酵母GTP1基因，其特征在于，所述的GTP1体外缺失片段序列如SEQIDNO：3所示。6.包含权利要求1-5任意一项所述基因的重组载体。7.包含权利要求6所述重组载体的宿主细胞。8.一种表达外源蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株含有权利要求1-5任意一项所述的突变的毕赤酵母GTP1基因。9.根据权利要求8所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株是由酵母菌株X-33突变GTP1基因所得。10.根据权利要求9所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，于2016年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.12718。11.一种表达外源蛋白的毕赤酵母菌株表达系统，其特征在于，所述系统包括(1)权利要求8...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨艳坤，战春君，张震阳，白仲虎，刘秀霞，戴晓峰，詹锦玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32