禽类及禽蛋中表达的外源蛋白质制造技术

本发明专利技术提供将外源核酸序列稳定导入禽类基因组中以表达外源序列来改变禽类表型或产生所需蛋白质的载体和方法。具体说，产生能在输卵管中表达外源序列并使外源蛋白质沉积到禽蛋中的转基因禽。本发明专利技术包括含有外源蛋白质的禽蛋。本发明专利技术还提供在转基因禽输卵管中有效表达并沉积于禽蛋中的新形式干扰素和促红细胞生成素。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术人R.D.伊瓦瑞，A.J.哈维，J.A.莫里斯，G.刘和J.C.拉普
技术介绍
a)专利
本专利技术涉及将外源遗传物质导入禽类细胞以及使外源遗传物质在细胞中表达的载体和方法。本专利技术还涉及转基因禽类，包括鸡和火鸡，以及含有外源蛋白质的禽蛋。b)相关领域描述很多天然和合成的蛋白质已用于诊断和治疗性应用；很多其他蛋白质正处于开发或临床试验阶段。现有的蛋白质生产方法包括从天然来源中分离以及在细菌和哺乳动物细胞中重组生产。然而，因为这些蛋白质生产方法的复杂性和高成本，人们正在开发其他的方法。例如，已报道了在猪、绵羊、山羊和牛的奶中生产外源蛋白质的方法。这些方法有几个局限性，包括创始动物和产生转基因动物群体之间长时间传代次数，大量的管理和医疗成本，以及由于基因组中转基因插入位点的位置效应所致表达水平的变化。也正在利用大麦和黑麦的碾磨和麦芽工艺生产蛋白质。然而，植物的翻译后修饰与脊椎动物的翻译后修饰有所不同，这种不同常对外源蛋白质的功能产生决定性影响。将输卵管作为生物反应器如组织培养和乳腺生物反应器一样，禽类的输卵管也可能作为生物反应器。修饰禽类遗传物质使高水平分泌外源蛋白质并包装于禽蛋中的方法成功使得能便宜地生产大量蛋白质。这种方法有几个优点a)减少了传代次数(24周)和通过人工授精可快速建立转基因群体；b)容易通过增加群体大小扩大生产规模以满足产品需求；c)所表达蛋白质可经历翻译后修饰；4)可自动喂养和收集蛋；d)卵清天然无菌；和e)由于卵清中蛋白质的浓度高从而降低了工艺成本。禽类包括鸡的生殖系统已有很好的描述。母鸡的蛋由经过输卵管时被分泌于卵黄上的几层组成。蛋的产生开始于母鸡卵巢中大卵黄的形成。然后未受精的卵母细胞定位于卵黄囊上部。随着排卵或卵黄从卵巢中排出，卵母细胞进入输卵管漏斗时，如果有精子，卵母细胞受精，然后进入有管状腺体细胞排列的输卵管蛋白分泌部(magnum)。这些腺体细胞可向蛋白分泌部腔中分泌卵清蛋白质，包括卵白蛋白、溶菌酶、卵类粘蛋白、伴白蛋白和卵粘蛋白，在腔中这些蛋白质沉积于禽胚胎和卵黄上。卵白蛋白基因编码一种在输卵管蛋白分泌部管状腺体细胞中特异表达的45kD的蛋白质，(Beato，Cell56335-344(1989))。卵白蛋白是含量最丰富的卵清蛋白质，包括50％以上的管状腺体细胞产生的总蛋白质，或每个大A级蛋约有4克蛋白质(Gilbert，“蛋的白蛋白及其形成”，Physiology and Biochemistry of theDomestic Fowl，Bell和Freeman，主编，科学出版社，伦敦，纽约，1291-1329页)。已经克隆和分析了卵白蛋白基因及其每侧区域20kb以上的序列(Lai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA752205-2209(1978)；Gannon等，Nature 278428-424(1979)；Roop等，Cell 1963-68(1980)；和Royal等，Nature279125-132(1975))。对卵白蛋白基因的调控给予了很大关注。该基因响应甾体激素，例如雌激素、糖皮质激素和黄体激素，这些激素可诱导未成熟仔鸡每个管状腺体细胞累积产生约70,000个卵白蛋白mRNA转录物，和诱导成熟产蛋母鸡每个管状腺体细胞100,000个卵清蛋白mRNA转录物(Palmiter，J.Biol.Chem.2488260-8270(1973)；Palmiter，Cell 4189-197(1975))。转染的管状腺体细胞中的DNA酶超敏性分析和启动子-报告基因试验确定了一个7.4kb的区域含有卵白蛋白基因表达所需的序列。此5’侧翼区含有四个从中心算起距离转录起始位点-0.25、-0.8、-3.2和-6.0kb的DNA酶I超敏感位点。这些位点分别称为HS-I、-II、-III和-IV。这些区域反映了染色质结构的改变，并且与输卵管细胞中卵白蛋白基因的表达特异性相关(Kaye等，EMBO 31137-1144(1984))。HS-II和-III的超敏性是雌激素诱导的，支持了这些区域在卵白蛋白基因表达的激素诱导中具有作用(的观点)。HS-I和-II都是卵白蛋白基因转录的甾体诱导所必需的，在移植的管状腺细胞中，含有这些元件的5’区的一个1.4kb部分足以驱动甾体依赖的卵清蛋白表达(Sanders和McKnight，Biochemistry 276550-6557(1988))。HS-I称为负响应元件(“NRE”)，因为它含有几个在缺少激素时能抑制卵白蛋白表达的负调控元件(Haekers等，Mol.Endo.91113-1126(1995))。蛋白因子结合于这些元件，包括一些只在输卵管核中发现的因子，提示这些因子在组织特异性表达中有作用。HS-II称为甾体依赖的响应元件(“SDRE”)，因为它对启动甾体诱导的转录是必需的。它可结合称为Chirp-I的蛋白质或蛋白质复合体。Chirp-I受雌激素诱导并在环己胺的存在下迅速转换(Dean等，Mol.Cell.Biol.162015-2024(1996))。利用移植的管状腺体细胞培养系统进行的实验确定了一套附加的以甾体依赖方式结合SDRE的因子，包括NFκB类似因子(Nordstrom等，J.Biol.Chem.26813193-13202(1993)；Schweers和Sanders，J.Biol.Chem.26610490-10497(1991))。关于HS-III和-IV的功能了解极少。HS-III包括功能性雌激素响应元件，当它与雌激素受体cDNA共转染入HeLa细胞时使卵清蛋白近端启动子或异源启动子具有雌激素诱导性。这些数据提示，HS-III可能在卵白蛋白基因的总体调控中起功能性作用。关于HS-IV的功能了解很少，只知道它不含有功能性雌激素响应元件。(Kato等，Cell 68731-742(1992))。通过导入外源遗传物质和/或打断特定基因来修饰真核基因组引起了人们很大的兴趣。已证明某些真核细胞可能是生产外源性真核蛋白质的优良宿主。导入编码某些蛋白质的基因还可能产生具有更高经济价值的新表型。此外，通过导入能使遗传缺陷型细胞表达其不能产生的蛋白质的外源基因，可治疗一些遗传疾病。最后，通过插入或去除遗传物质对动物基因组进行修饰，有助于基因功能的基础研究，并可能最终导入用于治疗疾病的基因，或者改进动物的表型。转基因动物已用几种不同的方法实现了哺乳动物的转基因。第一，在哺乳动物包括小鼠、猪、山羊、绵羊和牛中，将转基因显微注射入受精卵的原核，然后将受精卵放于代孕母体的子宫内，在其中受精卵发育成其种系中携带有转基因的创始动物。用工程方法改造的转基因携带有含特定调控序列指导外源蛋白质在特定类型细胞中表达的启动子。因为转基因是随机插入基因组的，所以转基因插入基因组位点的位置效应可能不同程度地引起转基因表达水平的下降。该方法还要求对启动子进行鉴定，以使指导在所需类型细胞中表达转基因的必要序列得以确定并包含在转基因载体中(Hogan等，小鼠胚胎操作，Cold Spring Harbor Laboratory，纽约(1988))。产生动物转基因的第二种方法是靶向基因打断，该方法中，将携带侧接有选择标记基因的目的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含编码序列和操作及位置上相关的启动子以在禽输卵管中表达所述编码序列的载体，其特征在于，所述编码序列选自重组转基因禽产生的干扰素－α２ｂ和促红细胞生成素的编码序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：RD伊瓦瑞，AJ哈维，JA莫里斯，G刘，JC拉普，
申请(专利权)人：阿维季尼克斯股份有限公司，佐治亚大学研究基金会股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]