RNA核滞留载体的构建及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能够将外源表达的RNA滞留在细胞核中的RNA表达载体，所述RNA表达载体由pZW1质粒改造获得，具体的，所述RNA表达载体为在pZW1的EGPF序列的多克隆位点区域中插入5’至3’方向依次排列的SNORD116-13片段、SNORD116-14片段所获得。本发明专利技术还进一步公开了所述RNA表达载体的构建方法以及在将外源表达的RNA滞留在细胞核中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生命科学核酸研究领域，具体涉及一种可以将外源表达的RNA滞留在 细胞核中的RNA表达载体及其制备与应用。
技术介绍
长非编码RNA (long noncoding RNA，IncRNA)长度大于200个核苷酸，但是 缺乏蛋白编码能力。在哺乳动物基因组的上千个位点可以产生IncRNA。已有很多研 究表明IncRNAs参与了一系列的基因表达调控和生物学过程（参见综述Ulitsky and Bartel, 2013 ;Batista and Chang, 2013)。截至目前，人们认为 IncRNAs 可以招募、组装、 修饰相互作用因子发挥作用等，如 NEATl (Mao et al.，2011)、H0TAIR(Rinn et al.，2007 ; Tsai et al·，2010)、ANRIL(Yap et al·，2010)、sn〇-lncRNAs (Yin et al·，2012)等。有意思 的是，许多IncRNAs所介导的调控是发生在细胞核内的，因此需要新的工具来研究IncRNAs 在细胞核内的功能。 如同研究编码基因一样，IncRNA也需要通过质粒载体将其在细胞里进行过表达来 研究。然而，目前已知的真核表达载体的设计目的是用来表达编码基因的，载体上含有转录 元件、翻译元件和一些促进核质运输（细胞核和细胞浆运输）的元件。因此，这些载体上的 转录本就会按照mRNA的加工方式进行加工，并且运到细胞浆里。即使一些仅定位在细胞核 中的内源IncRNAs，但是当用这些载体外源表达时，它们经常会被运到胞浆里，从而阻碍了 IncRNA的正常作用，导致出现错误的结论。 因此，针对上述现有技术中所存在的问题，基于实验室近期发现的一类新型的来 源于内含子的IncRNA sno-lncRNA，我们设计并构建了一种可以把所外源表达的任意RNA 滞留在细胞核内的表达载体，即"snoVector"，并证明了所述RNA载体可以稳定地表达所研 究的RNA序列，并成功地将其滞留在细胞核中，还进一步证明了所述RNA载体所表达的滞留 在细胞核的RNA可以发挥正常功能。 本专利技术为研究细胞核RNA的功能提供了工具支持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以将外源表达的RNA滞留在细胞核中的RNA表达载 体及其构建与应用，为研究IncRNA的功能提供工具支持。 本专利技术的第一方面，公开了一种RNA表达载体，所述载体用于将外源表达的RNA 滞留在细胞核中。所述RNA表达载体是由pZWl质粒改造获得，所述RNA表达载体为在 PZWl的EGPF(增强型绿色荧光蛋白）序列的多克隆位点区域插入5'至3'方向依次排列 的SN0RD116-13片段、SN0RD116-14片段所获得。其中，所述多克隆位点区域是指两个半个 EGFP外显子中间的内含子区域。 较优的，所述pZWl的EGFP序列如SEQN0. 1所示。其中，所述pZWl的EGFP序列的 起始密码子序列为ATG，终止密码子序列为TAA，内含子区域的序列为GTAAGTCTCGAGCTCAAG CTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGTCTCTTTCTTCCAGo 较优的，所述SNORDl 16-13片段的序列如SEQNO. 2所示，所述SNORDl 16-14片段的 序列如SEQN0. 3所示。 更优的，所述SN0RD116-13片段的插入位点为XhoI酶切位点和EcoRI酶切位点之 间，所述SN0RD116-14片段的插入位点为EcoR I酶切位点和SacII酶切位点之间。 最优的，所述RNA表达载体的EGPF序列的内含子区域的结构为： XhoI-BglII - SN0RD116-13 - EcoRI-PstI-SalI - KpnI - SN0RD116-14- PacI-SacIIo 引入酶切位点是为了便于插入外源序列。 本专利技术第二方面公开了前述RNA表达载体的构建方法：通过PCR的方法在所述 SN0RD116-13片段和SN0RD116-14片段的两端添加酶切位点序列，采用酶切、连接的方法将 所述SNORDl 16-13片段和SNORDl 16-14片段插入pZWl质粒载体，筛选、鉴定连接正确的连 接产物为本专利技术的RNA表达载体。 较优的，所述RNA表达载体适用于Hela细胞系和PAl细胞系等哺乳动物细胞系。 本专利技术的第三方面，提供了前述RNA表达载体在将外源表达的RNA滞留在细胞 核内进行过表达的应用。本专利技术的实施例中所列举的外源表达的RNA包括:mouse NEATl 全长序列及首尾相接的4种不同区域的NEATl片段（vl、v2、v3、v4)、ANKRD52的第二个 intron和第四个intron(部分）、Blasticidin抗性基因 、SNRPN mRNA的编码区（CDS)、 lncRNA-H0TAIR、pri-let_7g microRNA 部分片段。 本专利技术的第四方面，公开了一种将外源表达的RNA滞留在细胞核中的方法，所述 方法为将外源表达的RNA序列插入到本专利技术所述RNA表达载体的多克隆位点区域，通过所 述RNA表达载体将外源RNA运输至到并滞留在细胞核中。 本专利技术的有益效果为： LncRNA大部分位于细胞核中，而目前已有的哺乳动物真核表达载体却会使外源表 达的RNA运输到胞浆中，这限制了细胞核IncRNA功能的研究。目前还没有一种哺乳动物真 核表达载体可以将外源表达的RNA滞留在细胞核中。而本专利技术，首次构建了可以产生类似 sno-lncRNA分子结构的RNA表达载体，同时证明了其可以高效地将外源表达的RNA滞留在 细胞核中，解决了细胞核IncRNA研究领域中的一大障碍，为人们研究研究细胞核RNA提供 了新的手段，加快了人们对RNA功能和机制的研究。【附图说明】 1.图lpZWl-snoVector载体构建及表达验证 其中，图A为pZWl-snoVector表达载体结构示意图，两个绿色方框分别代表半个 的EGFP编码区，中间为intron，蓝色（左）和绿色（右）的圆圈分别代表SN0RD116-13 和SN0RD116-14snoRNAs ;图B为细胞转染实验结果，显示来自pZWl-snoVector表达载 体的pre-egfp融合转录本可发生正常剪接产生正常的EGFP蛋白，而来自空载体pZWl 的转录本不能正常剪接，没有产生突光；图C Northern Blot可以进一步检测到来自 pZWl-snoVector表达载体的转录本剪接下来的内含子加工形成sno-lncRNA ;探针为 SN0RD116-13 的探针。 2.图2以细胞核IncRNA mNEATl为例，研究pZWl-snoVector表达载体的外源表达 RNA细胞核滞留作用 其中，图A为mNEATl全长和4种不同的片段分别在pZWl-snoVector表达载体和 pEGFP-Cl对照载体中的示意图；图B和C转染HeLa细胞后，胞浆胞核分离和Northern Blot 手段检测 pZWl-snoVector 载体核滞留优于 pEGFP-Cl 载体；T :Total RNA，C:Cytosol RNA， N :Nuclear RNA ;图B用的是SN0RD11本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNA表达载体，由pZW1质粒改造获得，所述RNA表达载体为在pZW1的EGPF序列的多克隆位点区域插入5’至3’方向依次排列的SNORD116‑13片段、SNORD116‑14片段所获得，所述多克隆位点区域为所述EGFP序列的内含子区域。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玲玲，杨力，殷庆飞，胡世斌，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31