本发明专利技术公开了一种HBD3乳腺特异性表达载体及构建的重组细胞，该载体包含带有信号转导肽的HBD3基因，分别在HBD3基因的上游和下游设有CSN5和CSN3作为调控元件。所述的重组细胞其宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，将外源性表达载体pARNG-HBD3在φC31整合酶的作用下整合到假attP位点，通过药物筛选取得阳性克隆，再经过Cre重组酶的处理，去除载体上两个同向LoxP序列之间的抗生素筛选标记。以去除抗生素筛选标记的包含HBD3的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫有望生产出无抗生素筛选标记的转HBD3基因的奶牛。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种位点特异性整合的表达载体，特别涉及一种HBD3乳腺特异性表达载体及构建的重组细胞。
技术介绍
乳房炎是奶牛中很常见的疾病，这种炎症是由多种病原微生物引起的，以大肠杆菌(E. coli)和葡萄球菌(S. aureus)为主(Bannerman DD,Paape MJ,Lee Jff,Zhao X,HopeJC, Rainard P. Escherichia coli and Staphylococcus aureus elicit differentialinnate immune responses followingintramammary infection. ClinDiagn LabImmunol. 2004May； 11 (3) :463-72.)。乳房炎对奶业造成了巨大的经济损失，目前，治疗乳房炎仍以抗生素的投放为主，但抗生素价格昂贵；而且长期使用抗生素会使细菌产生抗药性，所以寻求一种新的治疗乳房炎的方法迫在眉睫。 自身能够特异性的在乳房携带或者分泌乳房炎的因子，是解决奶牛乳房炎的理想方法，而这需要依赖于现代生物技术来构建转基因奶牛来实现。而应用体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(Jang G, Bhuiyan MM, Jeon HY, Ko KH, Park HJ, KimMK, Kim JJ, Kang SK,Lee BC, Hwang WS. An approach for producing transgenic clonedcows by nuclear transferof cells transfectedwithhumanalphal-antitrypsingene.Theriogenology. 2006Jun ；65(9) :1800-12. Epub 2005Nov 21.)，其突出的优点是将转基因步骤提前到体细胞培养阶段，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞作为和供体细胞进行体细胞核移植(SCNT)，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以减低其生产成本(Wheeler MB,Walters EM. Transgenic technology andapplications in swine.Theriogenology. 2001Novl ；56(8) :1345-69.)。人0 -防御素3 (HBD3)是人体产生的一种大小为4_5kD的抗菌肽，由45个氨基酸组成，它具有光谱、强效的抗多种微生物感染的作用，特别是对金黄色葡萄球菌等阳性菌有强烈杀伤作用(Chen H, Xu Z, Peng L, Fang X, Yin X, Xu N, Cen P. Recent advances inthe research and development of human defensins. Peptides. 2006Apr ；27 (4) :931-40.Epub 20050ct 13.)。目前已有从人扁桃体组织、人新鲜包皮组织、新鲜的人肝癌组织等组织中克隆到了 HBD3的cDNA，并构建了各种HBD3表达载体，在大肠杆菌、人的某些细胞中得到表达。然而，现有的转基因动物生产技术仍然存在一定弊端外源基因的随机插入带来的位置效应，即外源基因随机插入到与细胞重要生命活动相关的基因内部引起其异常表达，或者外源基因插入异染色质区造成外源基因表达沉默；体细胞核移植技术作为转基因动物生产的有效有段，其突出优点是将基因转移提前到体细胞培养阶段，可以有效的提高转基因动物的出生率和控制生产成本,一般的，核供体细胞的准备需要经过药物筛选获得，而最终转基因细胞中抗生素筛选标记的残留，对转基因动物安全及环境安全造成了潜在的威胁。近年来，链霉菌噬菌体0C31整合酶能够催化链霉菌基因组中的attB位点和噬菌体基因组attP位点之间的同源重组引人关注。0 C31整合酶介导的重组具有单向整合、无需外界化学能源和辅助因子、胜任大片段基因有效整合、可在多种高等植物和动物细胞中发挥作用及外源基因可长期高效表达等特点，已经成为继Cre重组酶和FLP重组酶之后的又一种基因修饰的有力工具，越来越多的用于转基因研究。而有关假attP位点在基因组分布规律方面的研究表明，假attP位点多位于基因间或基因 内含子内，整合很少发生在基因的外显子中。这种偏向于转录活跃区的整合有利于基因的表达，这有可能是整合酶介导的整合与随机整合相比普遍有较长时间高水平表达的原因。而且,整合位点不偏好于转录起始位点,Sivalingam 等发现,超过70%的整合位点位于转录起始位点50kb以外。因此，从这方面来讲，0C31整合酶介导的整合潜在的安全隐患较随机插入和病毒载体系统要小的多。此外，选择标记基因在转基因的研究中是一个用于区分转化细胞和非转化细胞的必不可少的重要基因，它的使用大大加速了转基因技术的发展。但选择标记基因也带来了一些不利因素目前广泛使用的有效标记基因只有少数几种，而在基因工程操作过程中往往需要对同一基因片段进行多次转化，这时不易找到合适的选择标记基因；另外选择标记基因的表达可能会对转化细胞中的其它基因的表达产生负面作用，导致结果分析的复杂化；同时选择标记基因在转基因作物中的存在增加了它们分布环境的不确定性，由此带来转基因动植物的环境安全性问题，这些对转基因动植物的环境释放有很大的制约作用。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种HBD3乳腺特异性表达载体及构建的重组细胞，克服了当前转基因动物生产过程中存在的随机整合的缺陷，提高了转基因动物生产的安全性，为克服奶牛乳房炎的转基因奶牛提供坚实的基础。本专利技术是通过以下技术方案来实现一种HBD3乳腺特异性表达载体，包含带有信号转导肽的HBD3基因，分别在HBD3基因的上游和下游设有CSN5和CSN3作为调控元件。所示的带有信号转导肽的HBD3基因的序列如SEQ. IC. NO. I所示；CSN5的序列如SEQ. ID. NO. 2 所示，CSN3 的序列如 SEQ. ID. NO. 3 所示。所述的CSN3的下游还设有pUC ori和attB序列。所述的attB序列的下游还设有CMV组成型启动子，CMV组成型启动子下游插入两个同向的LoxP元件，在LoxP元件下游设有第一荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子，在两个LoxP元件之间设有第二荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子和抗生素筛选元件。 所述的attB序列如SEQ. ID. NO. 4所示,所述的CMV组成型启动子为Pcmv IE启动子。所述的HBD3乳腺特异性表达载体，所述的第一荧光指示蛋白开放阅读框为绿色荧光蛋白EGFP开放阅读框，第二荧光指示蛋白开放阅读框为红色荧光蛋白DsRedl开放阅读框，其终止子均为Sv40终止子。所述的HBD3乳腺特异性表达载体为pARNG-HBD3，将HBD3基因插入到pARNG载体的CSN5和CSN3之间。一种重组牛胎儿成纤维细胞，宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，通过共转染的方式将外源性表达载体PARNG-HBD3在链霉菌噬菌体0C31整合酶的作用下整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组假attP位点，通过药物筛选取得阳性克隆，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余源，张涌，王勇胜，刘军，权富生，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，杨凌科元克隆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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