治疗神经损伤及再生神经细胞的载体构建体制造技术

本发明专利技术提供一种治疗神经损伤及再生神经细胞的载体构建体，包括病毒载体承载酸性成纤维细胞生长因子（ａＦＧＦ）之编码基因。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种治疗神经损伤或再生神经细胞的方法及其载体构建体，特别涉及一种治疗神经损伤或再生神经细胞之载体构建体的制备方法与用途。
技术介绍
在发生物理横切伤、外伤、挫伤、挤压伤、手术损伤或血管药理伤害包括出血性或缺氧伤害、神经退化、其它精神疾病所造成之急性或慢性神经系统损伤后，可能需要再生神经细胞并恢复切除神经组织(denervated tissues)内之神经连结。 在神经系统损伤后，一般修复受损神经的方式是对患者进行神经缝合手术以及神经移植，其它可行的神经损伤治疗包括移植新的神经细胞与支撑细胞、递送蛋白质以刺激在脊椎神经内之细胞再生及减低抑制脑细胞再生之策略。部分研究发现在大鼠脊椎神经损害部位或附近直接施以神经修复剂能修复受损的脊椎神经(Cheng等人，1996，Science 273510-513)。 美国专利申请公开号US20040267289之内容披露了修复神经根的方法，包括将脊椎动物之一部分末梢神经系统移近脊椎动物之一部分中枢或末梢神经系统，并在两部分间之缝隙敷上包含生长因子、纤维素源及其它重要元素的纤维蛋白胶混合物，使脊椎动物的该部分末梢神经系统与该部分中枢或末梢神经系统之间形成功能性连结。
技术实现思路
本专利技术一方面提供了一种治疗神经损伤的方法，包括递送酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)之编码基因至神经损伤部位，并在神经损伤部位表达该基因。 本专利技术另一方面提供了一种治疗神经损伤的载体构建体，包括承载aFGF之编码基因的病毒载体。 本专利技术再一方面提供了一种再生神经细胞的方法，包括递送aFGF之编码基因至神经细胞，并在神经细胞表达该基因。 本专利技术又一方面提供了一种再生神经细胞的载体构建体，包括承载aFGF之编码基因的病毒载体。 附图说明 前述内容及以下的专利技术详细说明，当参照附图时，将更佳地被了解。为了说明本专利技术之目的，在附图显示目前为较佳的具体实施例。然而，应了解的是，本专利技术不限于所显示之确切排列及方法。 在附图中图1A为一载体图，表示了A2殖株载体承载如SEQ ID NO1所示之人类aFGF基因；图1B为一载体图，表示了A4殖株载体承载如SEQ ID NO1所示之人类aFGF基因以及rep基因；图1C为一载体图，表示了腺相关病毒(AAV)噬菌体杂合噬质粒载体承载如SEQ ID NO1所示之人类aFGF基因、延长因子、聚腺苷酸化及土拨鼠肝炎病毒后转录调节元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptionalregulatory element)序列；图1D为一载体图，表示了AAV噬菌体辅助载体承载rep-2与cap-2基因；图2A为一条状图，呈现PC12细胞在AAV-aFGF之不同滴定浓度的脑神经分化。 图2B为一条状图，呈现PC12细胞在AAV-aFGF之不同滴定浓度的细胞增生。 图3A与3B为条状图，呈现活体外AAV-aFGF表达的定量分析，其中图3A显示蛋白印迹(Western Blot)分析在PC12细胞所分析的aFGF表达量，图3B显示蛋白印迹(Western Blot)分析在胞外区域所分析的aFGF表达量。 图4为一显微图像，显示稳定转染细胞在大鼠脊椎神经的腹角区域表达aFGF；图5A-5C为条状图，呈现活体内AAV-aFGF表达之定量蛋白印迹(Western Blot)分析，其中图5A显示在AAV-aFGF之不同滴定浓度时，aFGF mRNA在脊椎组织的绝对表达量，图5B显示在AAV-aFGF之不同滴定浓度时，aFGF在脊椎组织的校准表达量，及图5C显示在AAV-aFGF之不同滴定浓度时，纯化aFGF在脊椎组织的校准表达量；以及图6A与6B为条状图，呈现aFGF基因转导对行为评估的影响。 具体实施方式 为使本
技术实现思路
清楚易懂，以下将对所使用的专有名词做更详尽的解释。 在此所使用的冠词“一”意指一或多于一(也就是至少一)的文法对象之冠词，除非另行解释该冠词仅为以单一观念的特定使用。 “载体”是指包括分离核酸的物质组合，并可将该分离核酸输送至细胞内部。多数的公知载体包括但不限于线性聚核苷酸、与离子性或两性化合物(ionic or amphiphilic compounds)有关之聚核苷酸、质粒及病毒。因此“载体”一词包括自主复制质粒或病毒，也应解释为包括能加速核酸转入细胞之非质粒与非病毒化合物，例如多离胺酸化合物、微脂体及其类似物。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体及类似物。 “腺相关病毒(AAV)载体”是取自于血清型腺相关病毒的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5及AAVX7。 AAV载体也包括转录序列，如聚腺苷酸化位点(polyadenylation site)，还有选择性标记或报导基因、增强子序列及其它能诱导转录之控制要素。 AAV病毒粒子是指完整的病毒粒子，AAV病毒粒子可为野生型AAV病毒粒子(包括线性单链AAV核酸基因体与AAV外壳结合，也就是蛋白质外鞘)或重组AAV病毒粒子。AAV病毒粒子能装入单链AAV核酸分子(如一般定义的有义链/编码链或无义链/非编码链)，有义链与无义链均具有相同感染力。 “基因”是指聚核苷酸，包含至少一个开放读码区能在转录或翻译后编码特定多肽或蛋白质，可使用在此所述之任何多核苷酸序列来辨识相关基因的较大片段或全长编码序列，而分离较大片段序列的方法为所属
的技术人员所熟知。 互补脱氧核糖核酸库只包含由细胞内信息核糖核酸分子所合成之互补脱氧核糖核酸分子。 引物是指聚核苷酸，能与特定聚核苷酸模板产生专一性杂合并在合成互补聚核苷酸时提供起始点。在引发合成条件下(也就是当核苷酸、互补聚核苷酸模板及聚合化试剂，如DNA聚合酶存在时)放置聚核苷酸引物会发生此合成。引物一般为单链，但也可能为双链。引物一般为脱氧核糖核酸，但在许多应用中亦可使用多种合成及天然引物。引物是与模板互补并可设计为与模板杂合以作为合成的起始位点，但不必反映模板的确切序列。在此情况下，引物与模板的专一性杂合取决于杂合条件之严苛度。可以发色性、放射活性或荧光性分子部分标记引物，并作为可检测之分子部分。 寡核苷酸一般是指不超过大约50核苷酸的短聚核苷酸，并且当核苷序列是由DNA序列(也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C))所表示时，也包括了RNA序列(也就是A、尿嘧啶(U)、G、C)，其中U取代T。 定序引物是寡核苷酸引物，能与至少部分聚合苷酸互补并能通过DNA或RNA聚合酶类，如DNA聚合酶所延长，其中以公知方法结合定序引物到聚核苷酸并延长引物产生了与至少部分聚合苷酸互补的寡核苷酸转录本。 “报导基因”在此是指可由已知方法检测表达之基因，例如大肠杆菌的半乳糖酶(lacZ)基因可作为培养基内的报导基因，因为能使用已知方法通过对培养基添加呈色基质ο-硝基苯-β-半乳糖甘酶，检测lacZ基因的表达(Gerhardt等人，1994，Method for General and Molecular Bacteriology，美国微生物学会，哥伦比亚特区，华盛顿，第574页)。 “启本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗神经损伤的载体构建体，其包括病毒载体承载酸性成纤维细胞生长因子的编码基因。

【技术特征摘要】
US 2005-12-9 11/298,8211.一种治疗神经损伤的载体构建体，其包括病毒载体承载酸性成纤维细胞生长因子的编码基因。2.根据权利要求1所述的载体构建体，其中该基因具有如SEQ IDNO1所示之脱氧核糖核酸序列。3.根据权利要求1所述的载体构建体，其中该基因是aFGF的编码基因具有如SEQ ID NO2所示之氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的载体构建体，其中该病毒载体至少包括腺相关病毒基因与腺病毒基因的其中之一。5.根据权利要求4所述的载体构建体，其中以该病毒载体感染神经损伤部位，使该基因传递到该神经损伤部位并在该神经损伤部位表达该基因。6.根据权利要求5所述的载体构建体，其中该神经损伤部位至少包括神经器官、神经组织、可以载体转导的神经细胞系统及神经细胞或其突起所在位置的其中之一。7.根据权利要求1所述的载体构建体，其中还包括病毒基因体，使病毒载体装入病毒粒子。8.根据权利要求1所述的载体构建体，其中还包括报导基因。9.根据权利要求8所述的载体构建体，其中该报导基因是细菌半乳糖酶的互补...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑宏志，张佩德，
申请(专利权)人：郑宏志，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]