家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用。获得包含丝素轻链基因启动子、18s rRNA基因启动子、His 6序列、DDDDK、丝素轻链蛋白信号肽基因、丝素轻链基因polyA、家蚕肌动蛋白基因A3启动子、EGFP基因和SV40的3’序列，然后再构建质粒，第一表达框包括A3启动子、EGFP基因和SV40的3’序列，第二表达框包括丝素轻链基因启动子、18s rRNA基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、His 6序列、DDDDK和丝素轻链基因polyA，且含有ApaI和NheI两个酶切位点。本发明专利技术质粒减少了构建转基因家蚕donor质粒的构建工作量，提高了家蚕生物反应器工作效率，提高了外源蛋白的表达量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及了一种质粒及其构建方法与应用，尤其是涉及了一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用。
技术介绍
piggyBac转座子最初是从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368细胞株的基因组中分离得到的，是目前发现的转座活性最高的DNA转座子。piggyBac转座系统是一种非病毒载体，转座效率较高。与sleeping beauty相比，piggyBac载体容量较大，可携带18kb,可以实现多基因的共表达。piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器的研究开展了十几年，世界各国的科学家致力于外源基因的表达，已经建成了以丝素蛋白轻链启动子(Fib-L Promoter)、丝素蛋白重链启动子(Fib-H Promoter)和丝胶蛋白1启动子(Ser1Promoter)表达外源蛋白的转基因家蚕丝腺生物反应器。由于piggyBac载体多数含有两个表达框，具有较多的元件和相同的酶切位点，所以，每次表达不同的外源基因时，需要从头构建质粒，组装启动子、信号肽、外源基因、polyA等结构，费时费力，工作效率低下。另一方面，纵观十几年来国内外家蚕生物反应器的研究结果，转基因家蚕丝腺生物反应器的外源蛋白表达效率都很低，不管是丝胶启动子驱动表达的外源基因，还是丝素启动子驱动表达的外源基因，极大多数实验的表达量都没有在茧层量的1％左右，远远没有达到科学家们期望的象表达蚕丝蛋白那样的高效表达水平。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提出了一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用，具体是利用常规构建质粒的生物技术方法构建一种除目的基因外的、拥有包含其它所有必需元件的高效通用型质粒。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案的步骤如下：一、一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒：所述的质粒为pBac[A3-EGFP-SV40]-[FL692promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA]，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框。一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3Promoter–EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、18s rRNA、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA。所述的DDDDK-FLPA之间含有专一性的ApaI和NheI的两个酶切位点，两个酶切位点用于将质粒特异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。二、一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的构建方法：1)将3×P3、DsRed、SV40、FL 692、GFP和SV40的多个功能基因相依次连接获得包含3×P3-DsRed-SV40--FL 692-GFP-SV40功能元件的piggyBac质粒piggy-7801；2)以piggyBac质粒piggy-7801为模板，piggyBac质粒piggy-7801的碱基序列如SEQ ID NO.1，以如SEQ ID NO.2的ggtacctttagtggtctgttatgtgaccaatcg序列1和如SEQ ID NO.3的gaattccttaagcgcatattggacatcccttttc序列2为引物，采用PCR扩增获得丝素轻链基因启动子，该启动子5’端带有EcoRI和AflII两个酶切位点，3’端带有KpnI酶切位点，片段长度为700bp，该启动子的碱基序列如SEQ ID NO.4；3)用EcoRⅠ和KpnI双酶切pUC19质粒得到包含Amp抗性基因长度为2670bp的片段，连接包含Amp抗性基因长度为2670bp的片段和步骤2)获得的丝素轻链基因启动子，得到包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因的piggyBac质粒piggy-3378；4)用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切包含丝素轻链蛋白信号肽和六聚组氨酸的piggyBac质粒piggy-2767，piggyBac质粒piggy-2767的碱基序列如SEQ ID NO.5，得到长度为80bp包含FLSP-his的片段，FLSP-his的碱基序列如SEQ ID NO.6；5)用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切步骤3)获得的piggyBac质粒piggy-3378，得到长度为3372bp的包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因片段，连接包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因片段和步骤4)获得的包含FLSP-His6的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸(FL
692-FLSP-His 6)和Amp抗性基因的质粒piggy-3452；6)体外合成肠激酶酶切位点的两条DDDDK单链，其碱基序列如SEQ ID NO.7，通过在94℃退火处理后形成双链，用SalⅠ和PstⅠ双酶切步骤5)获得的质粒piggy-3452，得到长度为3442bp的包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸(FL 692-FLSP-His 6)和Amp抗性基因的片段；连接DDDDK双链与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸和Amp抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点DDDDK序列(FL 692-FLSP-His6-DDDDK)和Amp抗性基因的质粒piggy-3480；7)将丝素轻链基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点、人血清白蛋白基因和丝素轻链polyA的功能基因依次连接，获得包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点-人血清白蛋白基因-丝素轻链polyA(FL 692-FLSP-His 6-DDDDK-HSA-FLPA)的质粒piggy-8449，质粒piggy-8449的碱基序列如SEQ ID NO.8，以质粒piggy-8449为模板，以如SEQ ID NO.9的CTGCAGATAAGAACTGTAAATAATGTATATA序列3和如SEQ ID NO.10的AAGCTTAGATCTGTGTGACTGCTTCGGACTAC ATTCT序列4为引物，通过PCR扩增获得家蚕丝素蛋白轻链3’序列FLPA，其碱基序列如SEQ ID NO.11，该序列的5’端带有Pst酶切位点，3’端带有B glII和HindⅢ两个酶切位点，片段长614bp；用PstⅠ和HindⅢ双酶切步骤6)获得的质粒piggy-3480，得到长度为3472bp的包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列(FL 692-FLSP-His 6-DDDDK)和Amp抗性基因的片段；连接家蚕丝素蛋白轻链3’序列FLPA与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征在于：所述的质粒为pBac[A3‑EGFP‑SV40]‑[FL692promoter‑18s rRNA‑promoter‑FLSP‑His‑DDDDK‑FLPA]，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框。

【技术特征摘要】
1.一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征在于：所述的质粒为pBac[A3-EGFP-SV40]-[FL692promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His-DDDDK-FLPA]，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框。2.根据权利要求1所述的一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征在于：一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3Promoter–EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、18s rRNA启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA。3.根据权利要求1或2所述的一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征在于：所述的DDDDK-FLPA之间含有专一性的ApaI和NheI的两个酶切位点，两个酶切位点用于将质粒特异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。4.一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的构建方法，其特征在于该方法的步骤如下：1)将3×P3、DsRed、SV40、FL 692、GFP和SV40的多个功能基因相依次连接获得包含3×P3-DsRed-SV40--FL 692-GFP-SV40功能元件的piggyBac质粒piggy-7801；2)以piggyBac质粒piggy-7801为模板，以如SEQ ID NO.2的ggtacctttagtggtctgttatgtgaccaatcg序列1和如SEQ ID NO.3的gaattccttaagcgcatattggacatcccttttc序列2为引物，获得丝素轻链基因启动子；3)用EcoRⅠ和KpnI双酶切pUC19质粒得到包含Amp抗性基因长度为2670bp的片段，连接包含Amp抗性基因长度为2670bp的片段和步骤2)获得的丝素轻链基因启动子，得到包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因的piggyBac质粒piggy-3378；4)用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切包含丝素轻链蛋白信号肽和六聚组氨酸的
\tpiggyBac质粒piggy-2767，piggyBac质粒piggy-2767的碱基序列如SEQ ID NO.5，得到长度为80bp包含FLSP-His 6的片段(其碱基序列如SEQ ID NO.6)；5)用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切步骤3)获得的piggyBac质粒piggy-3378，得到长度为3372bp的包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因片段，连接包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因片段和步骤4)获得的包含FLSP-His6的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸(FL692-FLSP-His 6)和Amp抗性基因的质粒piggy-3452；6)体外合成肠激酶酶切位点的两条DDDDK单链，其碱基序列如SEQ ID NO.7，通过在94℃退火处理后形成双链，用SalⅠ和PstⅠ双酶切步骤5)获得的质粒piggy-3452，得到长度为3442bp的包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸和Amp抗性基因的片段；连接DDDDK双链与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸和Amp抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点DDDDK序列和Amp抗性基因的质粒piggy-3480；7)将丝素轻链基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点、人血清白蛋白基因和丝素轻链polyA的功能基因依次连接，获得包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点-人血清白蛋白基因-丝素轻链polyA的...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟伯雄，张玉玉，叶露鹏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33