基于豌豆质体蓝素PETE启动子的嵌合启动子制造技术

本发明专利技术涉及包含至少１个得自豌豆质体蓝素基因启动子的核酸序列的嵌合启动子，该核酸序列优选得自ｐｅｔＥ启动子。本发明专利技术还涉及这类嵌合启动子的生产方法，以及含有它们的表达框、载体、和转基因植物。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
〔说明〕本专利技术涉及嵌合表达启动子，特别是适合并适用于植物生物工程领域的。一般说来，表达启动子是生物工程和遗传操作领域中众所周知的。更具体就植物生物工程而论，编码希望在宿主细胞中产生的多肽的基因的表达程度常常取决于所用的启动子。遍在使用的各种启动子常常只是因为它们的组织特异性或表达强度而限于具体应用或特定细胞组织。例如，可能列举花椰菜花叶病毒的35S启动子，据说它与来源于nos基因的启动子相比是相对较强的启动子，这两种启动子都更特定地用于植物生物工程领域。因此，现在仍需要使得能够克服迄今常用的启动子所固有的那些问题的新颖而有用的启动子。在以WO97/20056号公布的PCT申请中已报道了解决该问题的一种尝试，它描述了通过在已知的启动子中使用“增强子”(即对启动子的活性具有正向作用)来增加基因表达的程度。“增强”核苷酸序列富有A和T碱基，所述碱基的总量占该“增强子”核苷酸序列的50％以上。特别是，该PCT申请的申请人详细说明了来源于豌豆质体蓝素启动子的“增强子”区的用途。此处以及权利要求书中所用的表达方式将具有以下含义-“核酸”是指DNA或RNA；-“核酸序列”是指从5’末端朝向3’末端阅读的核苷酸碱基的单链或双链低聚体或多聚体，它包括自我复制型质粒、基因、感染或非感染性DNA或RNA的聚合体以及功能或非功能性DNA或RNA。在本申请所用的核苷酸符号标示中，除非另有说明，否则单链核苷酸序列的左手末端是5’末端；-“衍生核酸序列”是指从某序列例如通过一个或多个核苷酸的置换、缺失、添加、突变、断裂和/或合成而直接或间接得到的序列；-“启动子”或“启动子核酸序列”是指翻译起始密码子的核酸上游区，它参与识别和结合RNA聚合酶以及与转录有关的其他蛋白质；-“植物启动子”是指能够引发植物细胞转录的启动子；-“组成型启动子”是指能够在所述生物体的整个发育过程中在该宿主生物体的所有或几乎所有组织中表达与所述启动子操作性连接的核酸序列的启动子；-“组织特异性启动子”是指能够以选择性方式在宿主生物体的某些特定组织中表达与所述启动子操作性连接的核酸序列的启动子；-“操作性或功能性连接”是指将启动子或启动子核酸序列与要表达的编码希望产生的蛋白质的核酸序列或基因连接，连接的方式要使得该启动子真正影响或驱动该连接核酸序列的转录。应当理解，该启动子序列还可包括位于转录起始位点和翻译起始密码子之间的转录序列；-“要表达的编码希望产生的多肽的核酸序列或基因”是指编码多肽、优选外源或异源多肽的基因或核酸序列，所述外源多肽更优选药学、治疗学或化妆品学上的活性物质，诸如蛋白质、酶、抑制剂、受体、抗体、抗原、其治疗活性片段。可以通过相应基因或核酸序列在宿主细胞中的表达生产的例举性的异源或外源治疗活性物质是结构蛋白，诸如胶原，铁转移蛋白或运铁蛋白，诸如乳铁蛋白，血液衍生蛋白，诸如血红蛋白，人血清白蛋白，红细胞生成素，生长刺激因子，蛋白水解酶或抗蛋白水解酶，诸如α-抗胰蛋白酶，激素，次生代谢物，消化酶，诸如胃脂肪酶，胰脂肪酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，醇脱氢酶，脑衍生的神经营养因子，心刺激剂或调节剂，以及血压控制剂诸如血管紧张素；-“表达框”是指能够驱动编码希望在与这类表达框序列相容的宿主生物体中产生的多肽的核酸序列或基因的表达的核苷酸序列。这类表达框一般至少包括一个启动子和转录终止信号，以及可选的用于表达或表达所需的其他因子；-“载体”是指表达系统，例如用DNA包被的发射物、基于核酸的转运载体、适于传递核酸序列的核酸分子、和自我复制型自主环状DNA，例如质粒、粘粒、噬菌粒等等。当重组微生物或重组细胞培养物描述为“表达载体”的宿主时，这还可包括环状染色体外DNA(诸如象线粒体或叶绿体DNA)，已整合到宿主染色体中的DNA，或者作为整合到宿主基因组中的自主结构在有丝分裂期间通过细胞稳定复制、或者保持在宿主的核或胞质中的载体；-“质粒”是指能够在细胞中复制的自主环状DNA分子，包括“表达质粒”和“非表达质粒”。当重组微生物或细胞培养物描述为“表达质粒”的宿主时，这还包括环状染色体外DNA分子和已整合到宿主染色体中的DNA分子。若质粒保持在宿主细胞中，则该质粒或者作为自主结构在有丝分裂期间由细胞稳定复制，或者整合到宿主基因组中；“异源序列”或“异源核酸序列”是指来源于对环境来说是外来的来源或种的序列，或者若是来自相同环境，则已对其原始形式进行了修饰。可以对核酸序列进行修饰，例如通过用限制酶处理核酸，以产生能够操作连接到启动子的核酸片段。修饰也可以通过使用象位点特异性诱变等技术进行；-“盒”是指赋予调节功能的核酸序列；-“…样”是指包含与作为参照指示的已知盒和/或已知核酸序列相同或同源的某种序列的与该术语相联系的盒和/或核酸序列，优选与参比序列至少50％的序列同一性，甚至更优选至少75％的序列同一性，首选至少90％的序列同一性。序列同一性百分数是在至少6个邻接核苷酸碱基的比较窗口的基础上计算出的。可以使用序列对齐算法来确定比较窗口，以确定与参比序列的同源性，例如局部同源性算法、同源性对齐算法和相似检索算法，这些算法也有计算机程序形式，命名为诸如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。序列同一性百分数通过使用上述一种或多种方法比较参比序列与盒和/或核酸序列得到；-“位于”是指鉴定元件核酸序列上的位置，诸如“盒”、限制位点或具有特定功能的密码子。用数字给出的位置指的是该元件在核酸序列中的起始位置，是以核酸序列的读框方向来说的，即，以相对于标明为+1的转录起始位点的位置的5’→3’方向；-“转基因植物”是指通过应用基因操作技术得到的植物，包括用这类技术得到的完整植物、它们的后代、以及利用这类技术得到的植物器官，例如但不限于根、茎和叶。按照本专利技术得到的转基因植物还可以有不同的倍性水平，可以是例如多倍体、二倍体和单倍体；-“繁殖体”是指能够使从其再生完整植物的、有结构或无特定结构的植物细胞的累积块或联合或集合体；这类联合体可以是例如外植体、愈伤组织、茎、叶、根、插枝、甚至是种子的形式。本申请人采用了与前面所讨论的PCT申请的申请人所用的完全不同的方法。奇迹般地，本申请人已设法生产了满足前述需要的嵌合启动子，特别是相对现有的常用启动子来说，能够增加编码希望在宿主细胞中、优选在植物细胞中产生的多肽的基因或与所述启动子操作性连接的核酸序列的表达程度的嵌合启动子。另外，为了能够选出最适合特定任务或应用或打算要使用的环境的启动子，本申请人同时设法生产了一族启动子，并因此能够控制要表达的基因或编码希望在宿主细胞中产生的多肽的与所述启动子操作性连接的核酸序列的表达程度。所以，本专利技术的一个目的是包含至少一个得自豌豆质体蓝素基因启动子的、具有SEQ.ID.No.01所述序列的核酸序列的嵌合表达启动子。优选地，该包含得自豌豆质体蓝素基因启动子的核酸序列的嵌合启动子选自下列成员在序列表中由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。另外，本申请本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含至少一个得自豌豆质体蓝素基因启动子的、具有ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．０１所述序列的核酸序列的嵌合表达启动子。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：I朗塞，V格鲁伯，M泰森，
申请(专利权)人：默里斯坦治疗公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]