一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法技术

本发明专利技术属于生物基因工程领域，提供了一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，由一个酶切的大肠杆菌ｐＥＴ－２８ａ质粒和一个酶切的枯草杆菌ｐＥ１９４质粒构成，所述的酶切的大肠杆菌ｐＥＴ－２８ａ质粒上插入有溶菌酶－抗菌肽功能片段和抗菌肽基因，本发明专利技术还提供了一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，该穿梭质粒转入原核生物以融合方式表达毒蛋白、杀菌肽等蛋白对宿主不表现毒杀作用，本发明专利技术构建的穿梭质粒可以经ＩＰＴＧ或者乳糖诱导，以提高基因表达水平；也适合于外分泌表达，外分泌表达的目的蛋白处理方便又没有内毒素污染，由于具有双功能启动子，不同基因都可在合适的正确方向插入基因进行表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种穿梭质粒，特别是一种双启动子可诱导 可分泌型穿梭质粒及其构建方法。
技术介绍
生物工程领域中，为了有效表达克隆基因，常常需要进行表达载体的构建。大肠杆 菌表达系统是基因工程研究中最常用的一种。它虽然不能如真核系统那样进行翻译后加 工，但大肠杆菌其遗传背景相对清楚，操作简便、生长周期短、经济安全，因此仍然是使用最 广泛、也是不可被替代的系统，在基因工程基础研究和实际应用中成为不可缺少的重要工 具。一些重要的外源基因在大肠杆菌中获得了占菌体总蛋白30%甚至40%多的高效表达 量。通常大肠杆菌表达载体应满足以下要求1、适用范围要广；2、基因表达量高；3、表达的 产物容易纯化；4、质粒稳定性要好。可是迄今为止还没有一个表达载体能完全满足上述要 求。就表达基因的质粒载体来说，一般最好要符合下面的条件1、表达载体要具有多拷贝 或高拷贝性；2、最好具有可诱导的强启动子；3、有强的转录终止序列；4、有最佳最有效的 翻译起始序列。而要是具有分泌表达则更具优越性，这样表达蛋白可正确折叠，更具生物 活性且产物可溶；而且表达的蛋白分泌到胞外，能方便分离纯化。在这些系统中，枯草杆菌 就具有这种功能，枯草杆菌还是一种非致病性微生物，对人畜无害，所以常被许多研究者作 为表达系统加以应用。但是在实际应用过程中，枯草杆菌质粒的提取与转化效率明显不如 常用的大肠杆菌。如果在大肠杆菌中进行DNA分子操作，显得简便易行，完成了基因操作 后，再在枯草杆菌中进行外源蛋白的高效表达，表达产物分泌于胞外，可以较好的解决和克 服大肠杆菌表达产生包涵体，需要变性复性的烦琐操作。所以构建大肠杆菌_枯草杆菌穿 梭表达分泌载体成为一个重要选择 0上个世纪后期，许多科学工作者构建 各类表达载体，以期能够在大肠杆菌、或者在枯草杆菌、或者在大肠杆菌-枯草杆菌等不同 的载体中同时高效表达基因。有的构建多功能启动子同时启动表达以提高表达水平等等。 所有的研究目的只有一个，那就是千方百计以最小成本换取最大表达产量，以降低表达产 物如生物医药产品的生产成本；或者大大减少研究开发的时间和成本。所以，公开发表有许 多不同表达载体构建成功的报导，以满足不同研究和生产目的的需要。这些表达载体进行 融合表达、有的非融合表达、有的进行分泌型表达、有的带纯化标签的表达等等。本专利技术构建的表达载体符合上述条件。本专利技术以杀菌肽牛乳铁蛋白、人源LL-37、 溶菌酶等这些对宿主产生毒杀作用的蛋白作为报告基因进行操作，更有优越性。能够克服 其对宿主的毒杀作用，进行在原核生物中表达重要目的蛋白更具有实际意义。溶菌酶是广泛存在于生物体内各器官、组织、血清或唾液的水解酶，在动植物、噬 菌体等生物体内都有发现。迄今相关的报道如鸟类溶菌酶、T4溶菌酶、P22溶菌酶、蛋清 溶菌酶等，有数十种之多。其中蛋清中的溶菌酶含量尤为丰富，占蛋清总蛋白的3. 4% 3.5%，使用也最广。溶菌酶是一种非特异性免疫分子，能够提高机体的免疫功能，同时还具有抗肿瘤、抗病毒、改善和增强巨噬细胞吞噬、消化功能。目前溶菌酶更多的是杀菌功能 的应用。溶菌酶是以裂解细菌细胞壁的N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酸葡萄糖酸(NAG) 间的(1-4)糖苷键而使细菌裂解杀灭细菌的。然而溶菌酶只能对部分革兰氏阳性菌起作 用，在作用于一类人、畜易感疾病的金葡菌时却难以凑效，对一些易致病的阴性菌(如大肠 杆菌)难有强的杀灭作用，表现出杀菌谱不广、效率有限的局限性。此后，研究者对溶菌酶 进行定点突变，开展对溶菌酶的基因改造研究，情况虽有改善但效果不显著。为解决杀菌 谱问题，实际应用中常需要与其他杀菌物质配伍使用，如添加抗生素，或添加生物碱、聚磷 酸、甘氨酸等其他物质，以此来增加杀菌效果和扩大杀菌谱，这些物质对于溶菌酶来说起到 了增效使用。人源溶菌酶是溶菌酶的一种来源，DNA序列与蛋清溶菌酶十分相似，仅多了 一个氨基酸，分子中同样含有八个半胱氨酸，八个半胱氨酸两两折叠形成四对二硫键，活性 位点也相同。除若干个别氨基酸有变化外，酶的作用方式和功能相同，人源溶菌酶作用溶 壁微球菌的活性要高出蛋清溶菌酶3倍。由于人源溶菌酶获得极其困难，不少研究者开 始利用基因工程技术克隆人源溶菌酶基因。人溶菌 酶与蛋清溶菌酶一样存在杀菌谱问题。寻找生物活性肽与之联合应用可以解决上述缺陷。如抗菌肽(Antibacterial peptides, ABP)就是一类功能肽，或称抗微生物肽或肽抗生素，是生物体内先天免疫的重 要组成成分。杀菌肽杀菌谱广，能杀灭抗生素耐药菌株，能抑杀真菌、病毒、寄生虫，甚至肿 瘤细胞和实体瘤等特点，重要的是杀菌肽使用不易产生耐药性突变，理化性质稳定、抗菌 机理独特，又容易溶于水，对高等动物正常细胞少有毒害等许多优点。因此专家预言经过 努力，有朝一日有望开发成为新一代抗细菌、真菌、病毒甚至是抗癌的药物。在美、日等发 达国家，用这些功能肽制成健康食品，如多肽饮料、多肽儿童餐、老人餐、多肽保健食品、抗 辐射含片等。可预见的将来活性多肽的应用将充满希望，成为最具绿色安全的一类杀菌 剂，充满活力。现在被发现并研究的杀菌肽有上百种之多，如天蚕素(cecropins)、蛙皮素 (Magainins)、蜂毒素(melittins)、蝉、蚕抗菌肽及鸡、奶牛和人的杀菌/通透性增加蛋白 (BPI)、人源抗菌肽LL-37等等。在生物体内这些杀菌多肽分泌量极少，获取十分困难，现在 以化学合成这些杀菌多肽在国内还基本局限在研究领域，有规模的应用其趋势并没形成， 原因就是成本成了扩大应用的最大问题。应用基因工程方法克隆并表达杀菌肽成为首选 克隆和表达杀菌肽都需 要克服几个障碍。1，由于杀菌肽分子量都比较小，一般都在几十个氨基酸左右，所以表达时 表达量并不高；2，适合于表达抗菌肽的表达系统十分有限，一般只能在真核生物如酵母或 奶牛乳腺或昆虫等进行表达，如果用原核生物作为宿主来表达存在表达产物毒害或杀灭宿 主自身的问题，所以一般并不能直接在原核生物中表达，高表达或分泌型表达更为困难；3， 正因为杀菌肽分子量小，一旦表达过量非常容易被宿主菌蛋白酶识别降解。因此表达杀菌 肽常与其他大分子蛋白融合表达，但融合表达会使杀菌肽失去杀菌功能；4，为使表达的融 合蛋白具有生物学活性，需要对表达产物进行有效切割，从融合状态释放出杀菌肽恢复杀菌功能。目前常用切割方法有使用肠激酶、凝血酶、Xa因子或BrCN等。BrCN是有毒化学 品；使用凝血酶等酶类则价格昂贵而制约了融合杀菌多肽规模化生产和应用。只有解决了 上述这些问题才能真正进行规模化生产。本专利技术以杀菌肽、溶菌酶为报告基因，比较构建的 双启动子诱导分泌型穿梭质粒表达杀菌肽、溶菌酶情况。效果显著。不同的基因克隆到表达 载体后同时能够在不同表达系统中获得分泌型表达，方便地找到最佳表达杀菌肽的表达系 统，减少研究时间和成本。通过本专利技术的穿梭质粒载体表达更具重要药用价值的酶、蛋白、 激素等将更具现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，所 述的这种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法要解决现有技术中的载体表达 杀菌肽的量小，或成本过大而不能大规模生产的技术问题。本专利技术提供了一种双启动子可诱导可分泌型穿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于：由一个ＰｓｔＩ酶切的大肠杆菌ｐＥＴ－２８ａ质粒和一个ＰｓｔＩ酶切的枯草杆菌ｐＥ１９４质粒构成，所述的酶切的大肠杆菌ｐＥＴ－２８ａ质粒上插入有溶菌酶－抗菌肽功能片段和抗菌肽基因，所述的溶菌酶－抗菌肽功能片段由溶菌酶和抗菌肽基因融合而成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：乐科易，张培德，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]