水稻雄蕊和浆片表达启动子STA4及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种水稻雄蕊和浆片表达启动子，本发明专利技术的水稻雄蕊和浆片表达启动子包含：如序列表SEQ ID No 1或2中所述的核苷酸序列或其衍生物。本发明专利技术还提供了利用该启动子而构建的重组表达载体、表达盒以及宿主菌。通过将本发明专利技术的启动子连接到待表达的基因并利用载体转入到水稻植株中，能够驱动外源基因在水稻的雄蕊和浆片中表达。在雄蕊和浆片细胞中特异表达的启动子，在研究水稻受精作用将会是一个有用的工具。随着分子生物学和发育生物学的发展，人们对这种特异表达启动子的需求日益强烈，本发明专利技术提供的启动子刚好满足了这样的需求。其尤其是对如雄性不育植株培养、育种等方面具有非常巨大的潜在商业价值。

【技术实现步骤摘要】
水稻雄蕊和浆片表达启动子STA4及其应用
本专利技术涉及一种从植物中分离的启动子，尤其涉及从水稻中分离的雄蕊、浆片特异表达启动子，本专利技术还涉及含有该雄蕊、浆片特异表达启动子的重组表达载体、宿主细胞以及在改良植物性状、培育植物新品种等方面的应用，属于植物组织或器官特异性表达启动子的分离及其应用领域。
技术介绍
随着遗传转化技术的发展，基因工程已经成为基因功能研究和作物遗传改良的一项重要手段。启动子作为基因工程中表达载体的一个重要组成部分，它的选择与应用决定了目的基因在时间和空间上的表达不同。因此，克隆并深入研究启动子的结构对于理解基因在转录水平的调控机制有着较大帮助，同时也可以为基因工程中调控目的基因表达提供有利的工具。早期关于禾本科启动子的研究主要集中在组成型启动子的功能及应用方面，比如玉米的Ubiquitin启动子、水稻Actin1启动子以及OsCc1启动子。但是组成型启动子这种驱动外源基因在各组织中持续恒定的表达模式可能会引起水稻发育迟缓、产量减少或者转基因沉默(Mourrainetal.,2007)以及一些食品安全性等方面的担忧等问题(Conneretal,.2003)。因此，越来越多的科学家开始关注组织特异型启动子的研究与应用，进而达到改良水稻相应性状的目的(姚秋林和林拥军，2011)。组织特异型启动子能将外源基因限定在特定的组织或器官进行表达，而且多受到发育阶段的调节。这样的特性使得组织特异型启动子不仅可以提高外源基因在特定部位的表达浓度，增强转基因的效果，而且同时还能减少异源基因表达产物对植物发育的影响，降低植物耗能。水稻是我国乃至世界的主要粮食作物。水稻作为模式单子叶植物，是单子叶植物花器官研究的主要对象，水稻的颖花由1个外稃、一个内稃，2个浆片、6枚雄蕊和一个雌蕊组成。而水稻植物花器官的发育形成过程需要许多基因的协同表达，同时还涉及到一系列生化变化和组织器官的分化，在基因工程中有望可以利用这一类启动子，尤其雄蕊和浆片特异表达启动子创造雄性不育系。Gomez等从豌豆中分离得到一个花药特异表达基因END1的启动子，将其融合GUS基因后转化到番茄、烟草和拟南芥中，分别验证转基因材料发现END1启动子可以在这几种植物中维持花药特异表达的模式(Gomezetal.,2004)。研究人员对来源于百合的LGC1基因启动子进行了克隆，经验证发现该启动子在雄配子细胞中特异表达，在研究花药发生和受精作用中将会是一个有用的工具(Singhetal.,2003)。随着分子生物学和发育生物学的发展，对花器官特异表达启动子，尤其是对雄蕊和浆片特异表达启动子的研究和开发具有十分重要的科学理论价值和潜在的商业价值(如雄性不育、育种等)。水稻作为非常重要的粮食作物之一，亦是功能基因组学研究的模式植物。但是目前人们所得到的水稻的组织特异性启动子的数量和种类都并不多，难以满足当前科研和生产的强烈需求，而且从就专利技术人基于现有报道的了解来看，人们尚且没有开发出能够在水稻的雄蕊和浆片中特异性表达的启动子。即便现有技术中有人分离出了一两种雄蕊和浆片特异性启动子，由于雄蕊和浆片是水稻生长发育中非常重要的两个部分，人们还是希望能够获得更多针对雄蕊和浆片的特异性启动子。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种驱动外源基因在雄蕊、浆片部位特异表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。本专利技术从水稻中分离克隆出雄蕊和浆片特异表达启动子STA4，为转基因水稻育种服务，同时有利于提高转基因作物的安全性，并为长远的启动子改造和设计储备资源。具体而言，本专利技术提供一种水稻雄蕊和浆片表达启动子，其特征在于，所述水稻雄蕊和浆片表达启动子包含：(a)SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列；或者(b)SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列；或者(c)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(d)在SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(e)与SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者(f)与SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者(g)在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(h)在SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(i)SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(j)SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(k)与带有SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列；或者(l)与带有SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列。进一步地，所述启动子分离自日本晴水稻的成熟种子，分离所采用的扩增引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQIDNO3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQIDNO4所示。此外，本专利技术还给出了一种DNA构建体，其特征是，所述DNA构建体包含所述的启动子。此外，本专利技术还给出了包含所述的启动子或所述的DNA构建体的植物表达盒。此外，本专利技术还给出了包含所述的启动子或所述的DNA构建体的重组表达载体。在所述重组表达载体中，所述启动子连接于待表达基因上游，所述待表达基因具有调控雄蕊以使其不育的功能。植物双元表达载体可以为pCAMBIA1391。通过该载体获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。本专利技术对获得的转基因水稻进行GUS表达定量检测发现，转基因植株在雄蕊、浆片部位上的Gus基因表达水平提高，从而证明该2898bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻雄蕊、浆片部位特异表达。此外，本专利技术还给出了包含所述启动子或所述DNA构建体的宿主菌或转化子。此外，本专利技术还给出了一种所述的植物雄蕊和浆片表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述的植物雄蕊和浆片表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。换言之，本专利技术的专利技术人从日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)中分离克隆STA4基因上游包括转录起始位点在内的2898bp的DNA序列，并将其命名为STA4(序列表中的SEQIDNo:1)。该启动子可以应用在单子叶植物中，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。需要说明的是：SEQIDNo：1和SEQIDNo：2中的启动子均为本申请的专利技术人获自日本晴水稻的启动子，只是SEQIDNo：1中的核苷酸包含了引物的留存部分，即“GCTTTGCTCTCTCTTTTCATTT”和“TAAGCTACAAATTTCAGTTCAT”(后者与反向引物的相应序列互补)。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻雄蕊和浆片表达启动子，其特征在于，所述水稻雄蕊和浆片表达启动子包含：(a)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者(b)SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列；或者(c)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(d)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(e)与SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者(f)与SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者(g)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(h)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(i)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(j)SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者(k)与带有SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列；或者(l)与带有SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列。...

【技术特征摘要】
1.一种水稻雄蕊和浆片表达启动子，其特征在于，所述水稻雄蕊和浆片表达启动子由下述序列构成：(a)SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列；或者(b)SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列。2.一种DNA构建体，其特征是，所述DNA构建体包含根据权利要求1所述的启动子。3.包含权利要求1中所述的启动子或权利要求2中所述的DNA构建体的植物表达盒。4.包含权利要求1中所述的启动子或权利要求2中所述的DNA构建体的重组表...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏鹏程，杨剑波，李浩，马卉，李莉，秦瑞英，杨亚春，许蓉芳，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：安徽;34