本发明专利技术涉及水稻根尖特异表达启动子Pro-Os02g54880及其应用，该启动子具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本发明专利技术从克隆水稻根尖特异表达启动子Pro-Os02g54880入手，通过对水稻根尖特异表达启动子Pro-Os02g54880的功能分析，从实验水平上验证了该启动子适用于启动目标基因在水稻根尖的特异性表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学、基因工程
，具体地说，涉及一种水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880及其应用。
技术介绍
通过转基因方法研究基因功能甚至改变重要作物的农艺性状已经成为一种常用手段。以往人们利用组成型启动子启动相关基因的表达，但这种方法不仅过分消耗了植株能量，而且可能得不到期望的表型。将目标基因以期望的水平在特定组织中表达对于研究基因功能、改良植物性状是切实可行的。因此，选择合适的器官特异启动子，有利于控制基 因在时间及空间上不同水平的表达，以减少过多的能量消耗以及不期望的其它性状。植物根系在土壤养分吸收中起重要作用，并且能与土壤微生物相互作用、分泌抗病虫物质以抵抗病菌对植物的侵袭。更重要的是，根系能够在各种非生物胁迫条件下保护地上部分，如干旱、酸性条件及重金属。当与养分吸收和耐胁迫相关的基因被特异的表达在根部细胞后，植物则会在营养匮乏及胁迫条件下正常生长。近些年，为了调控外源基因在转基因株系中不同时间及空间的表达，研究者已经克隆了很多具有不同器官或组织特异性的启动子。例如，从种子贮藏蛋白基因及非种子贮藏蛋白基因都克隆到了种子特异表达的启动子。几种花器官特异的启动子也已被鉴定。虽然已有少数根部特异表达的启动子被克隆并应用于基因功能的研究，但这些启动子中大部分只是在根部表达较强，并不完全特异在根中表达。另外，能够在水稻根尖特异表达的启动子更是鲜为人知。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880，其具有i) SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或ii) SEQ ID No. I所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。本专利技术还提供含有上述启动子的载体、含有上述启动子的转基因细胞系以及含有上述启动子的工程菌。本专利技术还提供含有上述启动子的转基因株系。本专利技术还提供水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为GUS基因、GFP基因、LUC基因等报告基因，或CKX基因、OsNAC IO基因等目标基因。优选下游基因为CKX基因或OsNACIO基因。当下游基因为CKX基因或OsNACIO基因时，可促进水稻根系生长并提高水稻抗旱能力。将水稻基因0s02g54880的起始密码子ATG上游2. 273kb序列扩增后，连接到⑶S表达载体PCAMBIA3301上，将构建好的载体转化水稻，获得转基因株系，并用GUS显示底物x-gluc对转基因植株染色,观察根尖部位的着色情况。本专利技术首次提出一个新的能够在水稻根尖部位特异表达启动子Pro-0s02g54880，该启动子适用于启动目标基因(如GUS基因或GFP基因)在水稻根尖的特异性表达。由于该启动子的特异性很强，因此为后续进一步确定根尖特异表达的顺式作用元件奠定了基础，且为植物抗逆基因工程研究提供了新的启动子元件。附图说明图I为本专利技术实施例2中构建的Pro-0s02g54880_GUS载体图谱。图2为本专利技术实施例2中转基因水稻不同组织器官的染色结果；其中，A为根系染色结果，B为叶片染色结果。图3为本专利技术实施例2中多个独立转基因株系的根和叶片中GUS活性测定结果。具体实施例方式·以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行或按照制造生产厂商的使用说明。实施例I水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880的克隆I. I生物材料I. I. I植物材料水稻转基因受体材料为日本品种‘kitaake’。I. I. 2菌株和载体使用的农杆菌菌株为EHA105，载体为pCAMBIA3301。I. 2 方法I. 2. I水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880的克隆及Pro-0s02g54880_GUS载体的构建以水稻日本晴叶片为材料，用天根植物基因组提取试剂盒提取水稻总DNA，进行PCR 扩增。登录 http://rice, plantbiology. msu. edu/analyses_search_locus. shtml 网站，找到水稻转录因子0s02g54880基因，根据其上游2. 273kb序列设计PCR扩增引物，并分别在两条引物的5’端添加与载体pCAMBIA3301线性化位点同源的15个碱基。引物序列分别为prol-F:5’-CCATGATTACGAATTCTCCCCCGTGTCAACTGGATA-3 ' ;prol_R:5’-CTCAGATCTACCATGGGGACGACGTACGACGATGGT-3’。PCR 扩增体系为PCR 反应缓冲液 25 μ l，dNTP 4 μ 1，ddH20 17. 5 μ I，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(购自 Takara 公司)O. 5 μ I。反应程序为热启动98°C 10秒，57°C 5秒，72°C 2. 5分钟，30个循环后72°C延伸10分钟，最后25°C反应结束。PCR结束后，用凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收PCR产物。载体pCAMBIA3301线性化通过常规酶切。限制性内切酶EcoR I和Nco I购自Fermentas公司，反应体系为5 μ I IOX反应缓冲液，2μ I EcoR I ,2μ I Nco I，质粒2yg，用ddH20补足至50μ I。PCR仪上37 °C反应20分钟。反应结束后，用凝胶回收试剂盒(Axygen公司)回收PCR产物。用丨n-Fusion HD Cloning KitCClontech公司)连接载体与目的片段。吸取2 μ I反应体系直接转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，并对重组质粒进行测序，所构建的载体Pro-0s02g54880-GUS图谱见图1，载体序列如SEQ ID No. 2所/Jn οI. 2. 2转基因水稻植株的获得取水稻‘kitaake’成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法将Pro-0s02g54880-GUS转入水稻愈伤组织中，用含有100 μ M的乙酰丁香酮和O. D.值为O. 7的农杆菌的AAM转化液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置于共培养基上进行共培养，25°C暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d,每IOd继代一次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每IOd继代一次。将分化出绿色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所 获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。用Basta筛选转基因水稻，长出4片幼叶后开始喷洒Basta(1:1000，V :V)，隔I天喷I次，共喷洒3次。共获得转基因水稻18株。其中，诱导培养基配方为N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5. 8^5. 9后加本文档来自技高网...
【技术保护点】
水稻根尖特异表达启动子Pro？Os02g54880，其特征在于，其具有：i）SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列；或ii）SEQ？ID？No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i）衍生的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.水稻根尖特异表达启动子Pro-0s02g54880，其特征在于，其具有 i)SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或 ii)SEQID No. I所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。2.含有权利要求I所述启动子的载体。3.含有权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘斌，张春雨，李宏宇，赵涛，刘军，林辰涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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