一个组成型表达启动子及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物生物技术领域，具体涉及一个大豆组成型表达启动子SOY001P的功能鉴定和应用。本发明专利技术所公开的SOY001P启动子在植物的根、茎、叶和花等组织器官中都有很强的表达活性，在植物转基因领域具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于植物生物
，具体涉及一个大豆组成型表达启动子SOY001P的功能鉴定和应用。本专利技术所公开的SOY001P启动子在植物的根、茎、叶和花等组织器官中都有很强的表达活性，在植物转基因领域具有很好的应用前景。【专利说明】一个组成型表达启动子及其应用
本专利技术属于植物生物
，具体涉及一个从大豆中分离的组成型表达启动子S0Y00IP的功能鉴定和应用。
技术介绍
外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。根据启动子驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型启动子和特异性启动子；组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转录；特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子。目前，农业生物
广泛应用的主要是一些组成型的强启动子，高活性的组成型启动子在植物基因功能研究和遗传改良中具有很好的应用前景。组成型启动子(constitutive promoter)之所以称之为组成型是因为这类启动子控制的基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织部位表达水平没有明显差异，其特点是表达持续、RNA和蛋白表达量相对恒定、不表现出时空和器官特异性、不受外界因素的诱导。目前在植物基因工程改良中使用最普遍的组成型启动子主要有花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、根癌农杆菌Ti质粒的胭脂碱合成酶基因NOS启动子、水稻actin启动子以及玉米泛素蛋白Ubiquitin启动子。CaMV35S启动子和NOS启动子能够驱动外源基因在大部分植物中表达，如在转基因水稻、拟南芥、小麦等植物的研究中均有应用，然而这些启动子毕竟不是来源植物，因此在植物基因工程中应用这些启动子可能会存在潜在的生物不安全性。有研究表明内源型启动子在驱动转基因盐藻外源基因的高效表达中比外源启动子更具有优势。因此，克隆植物内源组成型启动子非常重要。组成型启动子为植物基因工程中应用最早、最广泛的一类启动子。在转基因育种或研究基因功能时，为了充分发挥外源基因表达产物的功能一般都使用组成型启动子使外源基因在植物中高效、稳定、持久地表达。为了避免同时使用同一个启动子驱动2个或2个以上的外源基因而导致基因沉默或共抑制现象，需要用到不同的启动子分别驱动不同的外源基因、筛选基因和报告基因。虽然在先前的工作中也已经分离得到一些组成型启动子，但这些还远远不够，还需要我们做大量的工作。本专利技术通过实验分析，发现启动子S0Y001P呈现出很强的组成型表达特性，在S0Y00IP转基因拟南芥中，其所驱动的报告基因GUS在转基因拟南芥的根、茎、叶和花等器官中都表现出很强的表达水平，这些数据充分表明S0Y001P是一个很强的组成型表达启动子。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种从大豆中分离的组成型表达启动子。本专利技术的目的之二是提供含有上述组成型表达启动子的表达盒、表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。本专利技术的目的之三是将所述的组成型表达启动子以及含有该启动子的表达载体应用与调控异源核苷酸序列在植物中的转录或表达。本专利技术提供了一个能在植物各组织器官中驱动组成型表达的启动子核苷酸序列，及克隆并应用该启动子的方法。在一些实施方式中，包括(a)将核苷酸序列可操作地连接于包括SEQ ID No:1的启动子，以产生表达盒jP(b)生成含有该表达盒的转基因植物，由此在植物中表达所述核苷酸。在一些实施方式中，所述“生成”包括用表达盒转化植物细胞并从所转化的植物细胞中再生出植物。本专利技术所提供的组成型表达启动子，含有序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，还包含与SEQ ID No:1中所列核苷酸序列至少具有95%相似性的核苷酸序列，可以驱动操作性连接的核苷酸序列在植物各器官中的组成型表达。实施方案中的启动子核苷酸序列可用于从其它生物中分离相应序列，如其它植物(单子叶或双子叶植物等)。根据这些相应序列与本文所列序列间的序列同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本文所列的完整S0Y001P启动子序列(或其片段)间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。实施方案的启动子区域可从任何植物中分离，包括(但不限于)水稻、芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(Rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(Spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘鹿、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、薯蓣、观赏植物和松类等。本文中“启动子” 一 词指DNA调控序列，其中通常含有一个TATA盒，该序列能够指导RNA聚合酶II在合适的转录起始位点上起始特定编码序列的转录。启动子也可另外含有其他识别序列，它们通常位于TATA盒的上游或5’端，被称作上游启动子元件，这些元件能够影响转录速率。应认识到当鉴别了本文所公开的启动子区域的核苷酸序列后，分离并鉴定位于本文所鉴别的特定启动子区域上游的其它调控元件就属于现有技术范围了。因此，本文公开的启动子区域可另外包含上游调控元件，如负责组织特异性和时间特异性表达的元件、调控组成型表达的元件和增强子等。本文中的“组成型表达”是指目的基因在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达或变化很小这类基因的表达方式。本专利技术所提供的S0Y001P启动子就是一个在植物的各个发育阶段的根、茎、叶和花等组织器官中都有较强表达的组成型启动子。启动子的活性和强度可以根据其驱动的报告基因的mRNA或蛋白质的表达量来测定。报告基因(importer gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来确定目的基因的表达调控特性。常用的报告基因有(6-葡萄糖苷酸酶基因GUS，和绿色荧光蛋白基因GFP。本专利技术通过⑶S报告基因来检测启动子的活性和表达特性。根据⑶S基因检测所用的底物不同，有三种检测方法:组织化学法、分光光度法和荧光法(灵敏度为分光光度检测法最高)，其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷酸(X-Gluc )作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞转入了 GUS基因，并表达出了 GUS酶蛋白，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使各组织细胞中有⑶S表达活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性的强弱。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。本专利技术的实施案例中也包括DNA载体，该载体含有操作性连接于异源核苷酸序列上的启动子，该启动子含有本专利技术公开的序列，并可在植物细胞中驱动上述异源核苷酸序列进行表达。本专利技术的实施方案还提供了表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的组成型表达启动子，其特征在于，所述启动子包含SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列，或者与SEQ?ID?NO：1互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：周君莉，李早霞，吴洁芳，赵静，卫静，
申请(专利权)人：北京未名凯拓作物设计中心有限公司，
类型：发明
国别省市：