一种发掘水稻柱头外露特异性启动子的方法技术

本发明专利技术提供了一种发掘水稻柱头外露特异性启动子的方法，通过性状差异极端的亲本进行杂交，在其F4～F5自交后代中持续选择差异显著的个体，分别将其与非柱头外露的常规品种杂交，再回交，每代选择非轮回亲本的柱头外露性状，连续回交6～7代后，即成为遗传背景一致，但在柱头外露性状上极端差异的近等基因系；通过选取近等基因系适当时期的柱头为材料，进行全基因组表达芯片杂交，检测其时空表达模式，确选差异表达基因，进而克隆其上游的特异性启动子。本发明专利技术方法可靠，技术路线可行，是发掘水稻柱头这类特殊器官特异表达启动子的有效技术方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了，通过性状差异极端的亲本进行杂交，在其F4～F5自交后代中持续选择差异显著的个体，分别将其与非柱头外露的常规品种杂交，再回交，每代选择非轮回亲本的柱头外露性状，连续回交6～7代后，即成为遗传背景一致，但在柱头外露性状上极端差异的近等基因系；通过选取近等基因系适当时期的柱头为材料，进行全基因组表达芯片杂交，检测其时空表达模式，确选差异表达基因，进而克隆其上游的特异性启动子。本专利技术方法可靠，技术路线可行，是发掘水稻柱头这类特殊器官特异表达启动子的有效技术方法。【专利说明】
本专利技术属于生物
，尤其涉及。
技术介绍
水稻柱头外露是指开花时柱头伸到张开的颖壳之外，开花结束后颖壳闭合，但柱头仍留在颖壳外的特性。在影响杂交水稻不育系异交性能和结实率的雌性花器性状中，柱头外露率是最重要的因素。柱头外露可以在一定程度上克服颖壳对外源花粉的供粉障碍，并延长柱头授粉时间，降低父母本花时差异对异交结实率的影响，从而提高异交结实率，增加杂交稻的繁殖制种产量。因此，研究水稻柱头外露特性是水稻育种家们的重要目标之一，对水稻柱头外露性状的遗传研究意义重大。 植物基因的表达调控已成为分子生物学研究热点，启动子是基因表达调控的重要顺式元件，启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。发掘新的诱导型启动子，无论对于基因表达调控机理的研究，还是在转基因研究加以利用都具有十分重要的科学意义。新的特异性启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。 柱头外露是水稻杂交育种非常重要的农艺性状，该性状存在着明显的基因型差异，属质量性状，不同性状的品种具有较大的表型差异。 目前，植物组织特异性启动子的发掘一般通过启动子捕获技术来获得，但该技术随机性大、假阳性高，需要利用基因枪等复杂设备，在发掘水稻柱头这类特殊器官的特异性表达的启动子时,往往力不从心。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，旨在解决水稻柱头外露性状基因启动子发掘的问题。 本专利技术是这样实现的，，包括以下步骤: 通过性状差异极端的亲本进行杂交，在其F4?F5自交后代中持续选择差异显著的个体，分别将其与非柱头外露的常规品种杂交，再回交，每代选择非轮回亲本的柱头外露性状，连续回交6?7代后，即成为遗传背景一致，但在柱头外露性状上极端差异的近等基因系； 通过选取近等基因系适当时期的柱头为材料，进行全基因组表达芯片杂交，检测其时空表达模式，确选差异表达基因，进而克隆其上游的特异性启动子。 相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果:本专利技术从材料构建上入手，通过应用表达谱基因芯片技术，检测差异表达基因，进而克隆其上游启动子，虽该技术在材料准备上具有一定的要求，选育周期较长，但都是常规的杂交选育，因此该方法可靠，技术路线可行，是发掘水稻柱头这类特殊器官特异表达启动子的有效技术方法。 【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。 实施例1水稻柱头外露近等基因系的构建 (I)通过性状差异极端的亲本进行杂交，选育中间材料，再与非外露的亲本材料连续回交，在其后代中持续选择差异显著的个体； 在步骤(I)中，利用柱头外露率100%的元江野生稻(采自元江)与非柱头外露的滇谋401 (项目组自育材料)杂交，选柱头外露率高的后代自交，再用F4自交系与滇谋401回交一次,再经过5代自交育成高柱头外露率的中间品系IL401，然后再用低柱头外露率的粳稻品种合系42 (云南省农科院粳稻课题组选育)作轮回亲本与IL401连续回交，选育高柱头外露率和柱头非外露但都与合系42为背景的新品系。此品系即为遗传背景相似，但柱头外露性状极端差异的供试材料。 (2)上述差异显著个体与非柱头外露的品种合系42连续回交，每代选择非轮回亲本的柱头外露性状，连续回交6?7代后，即成为遗传背景一致，但在柱头外露性状上极端差异的近等基因系； 近等基因系(NILs)的差异为可稳定遗传的质量性状差异，柱头外露率的广义遗传力高达96.86%，在花器官性状中选择效率最高，遗传变异系数最大，通过杂交选择方法来实现其性状改良的潜力较大。 实施例2特异性启动子的发掘 (I)通过选取近等基因系适当时期的柱头为材料，进行全基因组表达芯片杂交。 在步骤(I)中，于开花前一天取样，具体的芯片杂交送上海康成生物公司进行，该公司采用目前国际先进的64K全基因组表达芯片(Agilent公司生产)，该公司负责数据的采集和比对。选取表达差异10倍以上的候选基因进行后续分析。 (2)检测其时空表达模式，确选差异表达基因； 在步骤(2)中，水稻全基因组表达芯片共包含约5.7万个基因，每次芯片杂交可获得大约2.5万个基因呈阳性，对阳性信号进行均一化处理，然后将HSE芯片信号值与NSE的芯片信号值进行比较。对芯片数据进行分析，找到了差异表达基因6152个，其中差异表达上调10倍以上的157个，根据分析，上调表达10倍以上的基因中，有18个为信号传导相关，18个为转录因子相关，54个为能量物质代谢相关，17个为编码转运蛋白基因，10个为激素合成代谢相关，26个与胁迫抵御相关，及14个未知功能基因，选取11个候选基因克隆，它们的编号为 0sl2922、0s31669、0sAffx5702、0sAffx23995、0s2322、0s51106、0s29841、0s55613、0s51408、0sAffxl4892和0s56298，设计相应引物，用实时荧光定量PCR技术进一步检测。结果表明，筛选的候选基因在柱头外露的水稻中高表达，在非柱头外露的水稻及其他组织中表达较低。其中，芯片探针编号Os.51408.1.Sl_at等的表达水平显著提高，与芯片杂交结果比较相符。查询该基因探针在网上(http://plantb1l.genetics.ac.cn/rice-Affy/)公布的水稻各种器官的芯片表达值，表明该基因除在柱头表达较高外，在大部分的器官的表达水平较低，可以把其视为特异表达的基因。 (3)进而克隆其上游的特异性启动子。 在步骤(3)中，Os.51408.1.Sl_at对应的水稻基因为0s09g37490，该基因编码一auxin responsive genes一0sSAUR54,可以被外源激素诱导，再次证实该为柱头外露特异性表达基因，通过水稻全基因组数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),设计相应引物，反应程序和条件同常规，即克隆该启动子序列。 以上所述仅为本专利技术的较佳实施例而已，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。【权利要求】1.，其特征在于包括以下步骤: 通过性状差异极端的亲本进行杂交，在其F4?F5自交后代中持续选择差异显著的个体，分别将其与非柱头外露的常规品种杂交，再回交，每代选择非轮回亲本的柱头外露性状，连本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发掘水稻柱头外露特异性启动子的方法，其特征在于包括以下步骤：通过性状差异极端的亲本进行杂交，在其F4～F5自交后代中持续选择差异显著的个体，分别将其与非柱头外露的常规品种杂交，再回交，每代选择非轮回亲本的柱头外露性状，连续回交6～7代后，即成为遗传背景一致，但在柱头外露性状上极端差异的近等基因系；通过选取近等基因系适当时期的柱头为材料，进行全基因组表达芯片杂交，检测其时空表达模式，确选差异表达基因，进而克隆其上游的特异性启动子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周国华，
申请(专利权)人：宜春学院，
类型：发明
国别省市：江西;36