淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应用。本发明专利技术提供了一种DNA片段，为如下1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术克隆得到启动子NSE，NSE启动子驱动目的基因仅在淀粉胚乳之外的部分高效表达，将其运用于以淀粉胚乳为主要收获产物的作物中，对外源基因（如抗除草剂、抗病虫害等）进行选择性表达，既能节约能量，也能提高大众对转基因粮食的接受。

【技术实现步骤摘要】
淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应用。
技术介绍
在植物基因工程中，对以种子，果实为主要收获产物的植物，利用种子无表达启动子驱动目的基因仅在茎，叶等绿色组织中表达，而在种子食用部分无表达，是提高转基因食品安全性的有效策略。目前与植物种子不表达相关国内外专利举例如下：（1）申请号:201210202831.8：一种柑橘的绿色组织特异启动子；（2）申请号:200710051443.3：组织特异性表达启动子PD540及其在水稻改良中的应用；（3）申请号:01823070.9：营养生长特异性启动子及由此而得的基因重组植物；（4）申请号:96104811.5，一种豆荚内特异表达毒蛋白的转基因植物；（5）WO0077223:―PROMOTERENABLINGTRANSGENEEXPRESSIONINTHEWHOLEPLANTEXCEPTINTHESEED.(6)US2004117876:―Vegetativegrowth-specificpromoterandgeneticallymodifiedplantsobtainedthereby.(7)CN102417906:―ricegreentissue-specificpromoterPD54O-544,notexpressedinembryosandendosperms.(8)WO2008081478:―ChimericpromoterconstructedbyfusionofGhrbcSPandD35SPpromoters(expressedinalltissuesexceptseedendosperm)。这些专利为转基因植物的应用提供了有利启动子工具，但是由于不同专利涉及不同的启动子，其表达谱（即具体的表达部位和表达水平）存在明显差异；而且同一个启动子应用在不同的单，双子叶植物，甚至不同物种间时经常有不同的表达效果。因此现有的启动子资源难以满足植物基因工程的实际需求。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种DNA片段。本专利技术提供的DNA片段，为如下1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。上述严格条件可为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。含有上述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本专利技术保护的范围。上述重组载体为将上述DNA片段替换掉表达载体pCAMBIA-1300-SGN中的CaMV35S启动子，得到的重组载体。所述重组载体具体为将上述DNA片段取代pCAMBIA-1300-SGN的PstI和BamHI酶切识别位点间的小片段（CaMV35S启动子）得到的重组质粒。扩增上述DNA片段的全长或其任意片段的引物对也是本专利技术保护的范围。上述引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。上述DNA片段在植物中启动目的基因表达中的应用也是本专利技术保护的范围。上述应用中，所述目的基因表达为组织特异表达。上述应用中，所述组织为除种子淀粉胚乳以外的其他植物组织。上述应用中，所述除种子淀粉胚乳以外的其他植物组织为1）或2）：1）种子的胚、糊粉层或种皮；2）植物的根、叶鞘、茎、茎节、叶或穗。上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻；所述目的基因为GUS基因。单子叶植物水稻种子的结构包括种皮、胚和胚乳，其中胚乳又分为糊粉层（aleuronelayer）和淀粉胚乳（starchyendosperm）。在水稻加工成大米的过程中，种皮和果皮、胚以及胚乳的糊粉层都被破坏，而淀粉胚乳留下食用。本专利技术的实验证明，本专利技术克隆得到启动子NSE，NSE启动子驱动目的基因仅在淀粉胚乳之外的部分高效表达，是国内外首个淀粉胚乳特异非表达启动子，将其运用于以淀粉胚乳为主要收获产物的作物中，对外源基因（如抗除草剂、抗病虫害等）进行选择性表达，既能节约能量，也能提高大众对转基因粮食的接受。另外，水稻，玉米等作物种子的糊粉层中不仅富含蛋白质、B族维生素及矿质元素（P、K、Mg），也是赤霉素信号反应因子及α-淀粉酶合成的关键部位。NSE启动子在糊粉层中的高表达特性对作物育种中提高种子萌发率，改良种子品质等具有重要应用意义。附图说明图1为植物表达载体的构建及转NSE:GUS水稻的GUS染色分析图2为转NSE:GUS水稻种子的GUS染色分析图3为转NSE:GUS水稻干种子及种子萌发过程中的GUS染色分析具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、水稻NSE启动子的获得通过CTAB方法从水稻‘日本晴’（Oryzasativassp.japonicacultivarNipponbare，记载在YumanZhang,YongshengYan,LinaWang,KunYang,NaXiao,YunfengLiu,YapingFu,ZongxiuSun,RongxiangFang,XiaoyingChen.Anovelricegene,NRRrespondstomacronutrientdeficiencyandregulatesrootgrowth.Mol.Plant，2012,5(1):63-72.公众可从中国科学院微生物研究所获得。）叶片中提取基因组DNA，设计了正、反向特异引物NSE-S-Nsi:5’-ATGCATGCCCTGGCTAGCTTCTTCATCACTTC-3’（序列2）；NSE-R-BH:5’-GGATCCGGCCTGCACCGCAAATGGCGGATTTCC-3’（序列3）（带下划线的碱基为分别引入的NsiI和BamHI限制性酶切位点），采用TaKaRaLA-TaqDNA聚合酶进行PCR扩增，得到2,208bp的PCR产物。将该PCR产物送去测序，结果将该PCR产物所示的DNA分子命名为NSE，该DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列1。实施例2、水稻NSE启动子的功能验证1、重组载体的获得将实施例1得到的PCR产物经NsiI和BamHI酶切，得到2,208bp的酶切产物，将该酶切产物与经过PstI（与NsiI是同尾酶）和BamHI酶切的植物表达载体pCAMBIA-1300-SGN（记载在YumanZhang,YongshengYan,LinaWang,KunYang,NaXiao,YunfengLiu,YapingFu,ZongxiuSun,RongxiangFang,XiaoyingChen.Anovelricegene,NRRrespondstomacronutrientdeficiencyandregulatesrootgrowth.Mol.Plant，2012,5(1):63-72.公众可从中国科学院微生物研究所获得。该载体中驱动GUS基因表达的启动子为35S）连接，得到重组载体。采用引物NSE-S-Ns本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA片段，为如下1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.一种DNA片段，为序列表中序列1所示的DNA分子。2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1所述DNA片段替换掉表达载体pCAMBIA-1300-SGN中的CaMV35S启动子，得到的重组载体。4.扩增权利要求1所述DNA片段全长的引物对。5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于：所述引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：方荣祥，陈晓英，张玉满，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11