禽流感病毒miRNA及其鉴定、检测和应用制造技术

本发明专利技术涉及禽流感病毒miRNA及其鉴定、检测和应用。具体地，本发明专利技术通过检测禽流感动物的样本的microRNA表达谱水平，首次从中筛选出特异性的microRNA：miR-HA-3p。试验证明，该miR-HA-3p作为microRNA标志物可非常有效地检测禽流感病毒和禽流感。此外，通过抑制miR-HA-3p的功能，可以很有效地缓解禽流感症状和治疗禽流感。基于本发明专利技术首次揭示的microRNA，可以开发成检测试剂和治疗试剂以及相应的试剂盒，从而用于禽流感(如H5N1)的检测和治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物和医学领域，更具体地，涉及禽流感病毒miRNA及其鉴定、检测和应用。
技术介绍
流感病毒颗粒由两型表面糖蛋白覆盖，一型为植物血凝素(即H)，一型为神经氨酸酶(即N)，H又分15个亚型，N分9个亚型。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病毒中，H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性，H5N1是禽流感病毒的一种亚型。H5N1为卫生部新传染病防治法中规定报告的法定传染病，又称人感染高致病性禽流感。禽类流感根据其致病性可分为高致病性和低致病性。H5N1为高致病性禽流感病毒。1997年，H5N1病毒首次从中国香港一3岁儿童的流感死亡病例标本中分离鉴定出。至2012年，绝大多数的人类感染病例都直接来自鸟，只有个别的病例被认为是来自被感染的人，不过一般认为H5N1病毒尚未能在人与人之间建立持续的传播链。禽流感重症患者一般均为H5N1亚型病毒感染。患者呈急性起病，早期表现类似普通型流感。主要为发热，体温大多持续在39℃以上，热程1-7天，一般为3-4天，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛、肌肉酸痛和全身不适。部分患者可有恶心、腹痛、腹泻、稀水样便等消化道症状。重症患者病情发展迅速，可出现肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克等多种并发症。白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低。H5N1亚型禽流感病毒是目前发现的禽流感病毒中感染性最强、致死率最高、流行最广的一类病毒,该病毒已在世界上多个国家发生流行。当前针对该病尚无高效特异的治疗方法,进行疫苗的接种是目前比较有效的预防措施和关键环节。因此研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为当前禽流感防制工作的热点之一,针对疫苗的研制已经取得了大量的研究成果。但是，由于病毒变异速度快，变种种类多，现有疫苗研发速度并不能保证有效的抵抗病毒变种，所以，对H5N1侵染过程的深入研究及新治疗方法的开发更加迫在眉睫。微小核糖核酸，英文名为microRNA，简写作miRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，它们在进化上高度保守，广泛存在于生物细胞中。微小核糖核酸通过识别靶mRNA的3'端非翻译序列，与之不完全互补，从而抑制靶mRNA的翻译。其序列、结构、丰度和表达方式的多样性使微小核糖核酸成为信使RNA强有力的调节因子并在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用。微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，涉及生物个体发育；组织分化；细胞调亡以及能量代谢等生命活动的方方面面。同时，微小核糖核酸也与许多疾病的发生及发展存在千丝万缕的联系，在发生某种疾病时总有一些微小核糖核酸表达量是上调的，一些是下调的。已有相关研究表明，病毒或微生物在感染宿主细胞后，会编码特异性的miRNA，特异性miRNA作用于宿主免疫相关mRNA，调节宿主的细胞因子系统，进而影响宿主的免疫调节。综上所述，为了更有效地预防和治疗禽流感，本领域迫切需要开发可用于检测和治疗禽流感的相关试剂和方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供可有效用于检测和治疗禽流感的相关试剂和方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA选自：(i)序列如SEQ ID NO:1、2或3所示的miRNA，或(ii)长度为20-26nt，且具有SEQ ID NO.:4所示核心序列的miRNA；或(iii)与(i)或(ii)中所述miRNA的核苷酸序列互补的miRNA。在另一优选例中，所述的互补包括基本上互补(不互补的碱基≤3个，较佳地≤3个，更佳地≤1个)和完全互补。在另一优选例中，所述的miRNA来自禽流感病毒。在另一优选例中，所述的miRNA来自禽流感病毒H5N1。在另一优选例中，所述的miRNA分离自人或非人哺乳动物的血液、体液、或组织样品。在另一优选例中，所述的血液为血浆和/或血清。在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊等。在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。在本专利技术的第二方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在动物细胞内剪切并表达成如本专利技术第一方面所述的miRNA。在另一优选例中，所述的动物细胞包括人细胞。在本专利技术的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被动物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成如本专利技术第一方面所述的miRNA。在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：式I中，Seq正向为能在动物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列；Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。在本专利技术的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本专利技术第一方面所述的miRNA，或第二方面所述的多核苷酸。在本专利技术的第五方面，提供了本专利技术第一方面所述miRNA的用途，它被用于(a)制备检测禽流感的试剂、检测芯片或试剂盒；(b)制备调控PCBP2表达或活性的调节剂；(c)制备调控细胞因子表达的试剂。在另一优选例中，所述的调控PCBP2表达或活性的调节剂是下调PCBP2表达或活性的抑制剂。在另一优选例中，所述细胞因子包括：TNFα、IFN-β、IL-6、IL-1β、或其组合。在本专利技术的第六方面，提供了一种核酸芯片(如miRNA芯片)，所述芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性捕获本专利技术第一方面所述的miRNA。在本专利技术的第七方面，提供了本专利技术第六方面所述核酸芯片的用途，它被用于制备检测禽流感的试剂盒。在本专利技术的第八方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有第七方面所述的核酸芯片或本专利技术第一方面所述的miRNA。在本专利技术的第九方面，提供了一种特异性抑制或阻断本专利技术第一方面所述的miRNA的抑制剂。在另一优选例中，所述的抑制剂是miRNA海绵(sponge)、与miRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的miRNA，其特征在于，所述的miRNA选自：(i)序列如SEQ ID NO:1、2或3所示的miRNA，或(ii)长度为20‑26nt，且具有SEQ ID NO.:4所示核心序列的miRNA；或(iii)与(i)或(ii)中所述miRNA的核苷酸序列互补的miRNA。

【技术特征摘要】
1.一种分离的miRNA，其特征在于，所述的miRNA选自：
(i)序列如SEQ ID NO:1、2或3所示的miRNA，或
(ii)长度为20-26nt，且具有SEQ ID NO.:4所示核心序列的miRNA；或
(iii)与(i)或(ii)中所述miRNA的核苷酸序列互补的miRNA。
2.如权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述的miRNA来自禽流感病
毒，较佳地来自禽流感病毒H5N1。
3.一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在动物细胞
内剪切并表达成如权利要求1所述的miRNA。
4.一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被动物细胞转录成前体miRNA，
所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成如权利要求1所述的miRNA。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有式I
所示的结构：
式I中，
Seq正向为能在动物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和
Seq反向不互补；
并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
6.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的miRNA，或权
利要求4或5所述的多核苷酸。
7.权利要求1所述miRNA的用途，其特征在于，用于(a)...

【专利技术属性】
技术研发人员：张辰宇，曾科，王进，李西汉，
申请(专利权)人：江苏命码生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32