一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法技术

本发明专利技术提供了一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法，该方法包括提取癌细胞/正常细胞总RNA；DNase?I及RNase?I酶切；逆转录成cDNA及双链合成，加接头；抑制性消减杂交，PCR产物克隆建库，测序分析；对候选分子进行进一步实验验证等步骤。经在正常细胞和肿瘤细胞中应用验证，证实该方法可系统、快速的筛选人肿瘤相关的自然反义转录子。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术、生物医药领域，具体地，本专利技术涉及一种筛选人肿瘤相关自然反义转录子的方法。
技术介绍
自然反义转录子(natural antisense transcripts,以下称NAT)通常是指自然情况下生物体内生成的反义RNA(antisense RNA),它们与其对应的互补RNA(compIementaryRNA)通过互补碱基配对,形成双链的自然正义-反义转录子(natural sense-antisensetranscript,以下称NSAT)，引起靶基因的降解或翻译抑制来调控靶基因的表达。NAT按照其作用方式分为两种大多数NAT来源于与正义转录子相同的基因组位点，由编码正义转 录子的相对链所编码，称为顺式编码NAT (cis-NAT)，这类分子与靶基因的序列完全互补；与此相反，来源于与正义转录子不同的基因组位点的NAT称为反式编码NAT (trans-NAT),它们与靶基因序列只是部分互补。近年人们在研究NAT时发现，NAT表达水平的改变与人类肿瘤的发生和转移等密切相关，因此，NAT的异常表达被认为是研究肿瘤中不可忽视的重要因素。由于NAT的重要功能，目前国内外的多家研究机构对其进行了深入研究，发现自然界中可能存在的NAT远远超出我们最初的预期。这些研究大多采用生物信息学预测的方法，具有方便、快捷等优点，但所得结果不够可靠，且不能在特定的细胞或组织中系统筛选差异表达的NAT分子。为解决这些方法的局限和不足，我们利用双链RNA分子能够耐受RNaseI的降解，而单链RNA分子会被RNase I降解的原理，将提取的总RNA用RNase I酶切后再进行逆转录反应，就可以将在细胞内与祀分子以双链的NSAT (natural sense-antisense transcripts)形式存在的NAT分子从总RNA中分离出来，而且这种方法排除了人为干扰因素，理论上用该方法得到的NSAT应为自然条件下生物体内真实存在的。运用该原理，结合抑制性消减杂交等实验方法，我们就可以快速系统地筛选人正常细胞及对应的肿瘤细胞或正常组织及对应的癌组织间差异表达的NAT分子，从而获得人肿瘤相关的NAT分子。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于RNase保护分析及抑制性消减杂交的人肿瘤相关自然反义转录子的新型筛选方法。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案，包含以下步骤I)提取人正常细胞和对应的肿瘤细胞总RNA ；2)分别加入过量的DNase I和RNase I，酶切步骤I)获得的人正常细胞及对应的肿瘤细胞总RNA，然后通过酚/氯仿抽提回收；3)以步骤2)中的双链RNA为模板，以随机六引物及逆转录酶将其反转录为cDNA ；4)以随机六引物为引物，用T4DNA聚合酶催化合成cDNA第二链并补平末端；5)以Rsa I酶切双链cDNA，得到带有平末端的酶切产物，回收纯化后加双蒸水；6)将步骤5)的检测子cDNA分为两份，一份连接SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，一份连接SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；驱动子(Driver) cDNA不连接头；7)用T4DNA聚合酶补平粘末端，采用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化后，加适量双蒸水溶解；8)以正常细胞和癌细胞互为检测子和驱动子进行双向抑制性消减杂交；其中在正向消减中，以癌细胞为检测子，以正常细胞为驱动子；在反向消减中，以正常细胞为检测子，以癌细胞为驱动子；9)将步骤8)的杂交产物用缓冲液稀释后作为模板进行两轮PCR扩增；PCR的引物核苷酸序列对应于SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； 10)将步骤9)PCR扩增后的正向和反向消减杂交产物纯化，后与pGEM-T载体连接克隆，并分别构建正向和反向cDNA消减杂交文库，鉴定出阳性克隆后进行测序；11)根据步骤10)所获得的测序结果进行分析，确定候选的靶分子。进一步地，步骤I)之后还包括检测所提取的总RNA的步骤。进一步地，步骤3)中酶切条件为37°C水浴中酶切30min。进一步地，步骤5)中酶切双链cDNA时间为2h。进一步地，步骤5)中加双蒸水调整浓度至300ng/y I。进一步地，步骤9)中两轮PCR扩增循环次数分别为28和12。本专利技术还提供一种根据上述方法筛选的人肿瘤相关的自然反义转录子在制备检测肿瘤试剂盒中的应用。本专利技术还提供一种根据上述方法筛选的人肿瘤相关的自然反义转录子在制备检测肿瘤制剂中的应用。本专利技术的优点及有益效果本专利技术所述的基于RNase保护分析及抑制性消减杂交的人肿瘤相关自然反义转录子的新型筛选方法可用于系统、快速的筛选人肿瘤相关自然反义转录子，通过在多种正常细胞/癌细胞中的实验证实，采用本方法能有效的筛选人肿瘤相关自然反义转录子。附图说明图I是本专利技术提供的流程示意图；图2是pGEM-T载体的图谱；图3A-3B是总RNA经RNase I酶切前后产物电泳示意图，其中图3A为酶切前电泳示意图，图3B为酶切后电泳示意图；其中M为IOObp DNA梯状电泳；图4是文库质粒酶切图；其中M为IOObp DNA梯状电泳；图5A-5B是候选NATs分子ETl-AS测序结果图，其中图5A为测试结果第一页，图5B为测试结果第二页；图6是ETl-AS的表达对ETl mRNA表达水平的影响图；其中柱I为pcDNAET-AS转染Skov3细胞24h，柱2和柱3为pcDNAET-AS转染Skov3细胞48h，柱4为野生型Skov3细胞，柱5为pcDNA3转染Skov3细胞24h，柱6为pcDNA3转染Skov3细胞48h ;图7是ETl-AS的表达对ETl蛋白表达水平的影响图；其中泳道I为野生型Skov3细胞，泳道2为Skov3细胞转染pcDNA 3，泳道3为Skov3细胞转染pcDNAET_AS24h ;泳道4为 Skov3 细胞转染 pcDNAET-AS48h。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。如图I所示，本专利技术提供的筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法包含以下步骤I.细胞培养/组织标本材料的取材按各种细胞的优化培养条件培养目的细胞；如采用组织标本材料,则组织标本材 料应在术后立即直液氣中保存。2.总RNA的提取采用总RNA抽提试剂Trizol提取总RNA，操作步骤按Trizol试剂说明书进行。(I)在所得细胞中，按照I X IO7个细胞中加入Iml的Trizol试剂，反复吹打裂解细胞。如为组织，先加入适量Trizol试剂后用匀楽机进行研磨。(2)室温放置5分钟，使细胞充分裂解。(3)加入O. 5ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟。(4) 40C，12000rpm离心15分钟，液体分为三层。(5)取无色水相移至另一干净EP管中，加等量异丙醇颠倒混匀，室温放置10分钟。(6) 4°C, 12000rpm 离心 10 分钟，弃上清。(7)加入75 %乙醇洗涤RNA沉淀。(8)4°C，7500rpm离心5分钟，弃上清。加入无水乙醇洗涤沉淀，利于尽快去除水分。(9)加入20 μ I 二乙基焦碳酸酯(DEPC)水溶解沉淀，紫外分光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法，其特征在于，包含以下步骤：1）提取人正常细胞和对应的肿瘤细胞总RNA；2）分别加入过量的DNase？I和RNase？I，酶切步骤1）获得的人正常细胞及对应的肿瘤细胞总RNA，然后通过酚/氯仿抽提回收；3）以步骤2）中的双链RNA为模板，以随机六引物及逆转录酶将其反转录为cDNA；4）以随机六引物为引物，用T4DNA聚合酶催化合成cDNA第二链并补平末端；5）以Rsa？I酶切双链cDNA，得到带有平末端的酶切产物，回收纯化后加双蒸水；6）将步骤5）的检测子cDNA分为两份，一份连接SEQ？ID？NO:5所示的核苷酸序列，一份连接SEQ？ID？NO:6所示的核苷酸序列；驱动子(Driver)cDNA不连接头；7）用T4DNA聚合酶补平粘末端，采用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化后，加适量双蒸水溶解；8）以正常细胞和癌细胞互为检测子和驱动子进行双向抑制性消减杂交；其中在正向消减中，以癌细胞为检测子，以正常细胞为驱动子；在反向消减中,以正常细胞为检测子，以癌细胞为驱动子；9）将步骤8）的杂交产物用缓冲液稀释后作为模板进行两轮PCR扩增；PCR的引物核苷酸序列对应于SEQ？ID？NO:5所示的核苷酸序列和SEQ？ID？NO:6所示的核苷酸序列；10）将步骤9）PCR扩增后的正向和反向消减杂交产物纯化，后与pGEM？T载体连接克隆，并分别构建正向和反向cDNA消减杂交文库，鉴定出阳性克隆 后进行测序；11）根据步骤10）所获得的测序结果进行分析，确定候选的靶分子。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝辉，何凤田，张立，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：