一种人肿瘤标志物TBRG4多肽及其用途制造技术

本发明专利技术属生物技术和医学领域，涉及新的人肿瘤标志物TBRG4多肽，编码TBRG4的多核苷酸序列和经重组技术产生该蛋白的方法。本发明专利技术还涉及TBRG4蛋白及其编码序列的用途，以及含TBRG4蛋白拈抗剂的药物组合物。经实验显示，所述的TBRG4多肽及其编码序列及该基因的表达产物，在正常细胞和组织中几乎检测不到，在肿瘤细胞和组织中却有很高的表达，且表达量与肿瘤的级别，分化程度以及预后均呈明显正相关。结果表明TBRG4为一特异的肿瘤标志物，能作为乳腺癌的预防和早期检测的标志物或肿瘤治疗的靶标。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物技术和医学领域，涉及一种新的人肿瘤标志物TBRG4多肽(transforming growth factor beta regulator),编码 TBRG4 的多核苷酸序列和经重组技术产生该蛋白的方法。本专利技术还涉及TBRG4蛋白及其编码序列的用途。
技术介绍
目前肿瘤研究的最关键的问题之一即寻找早期检测，诊断分型，治疗监测和预后，以及作为药物靶标的生物标志物。生物标志物(biomarker)是指能被客观测量的，指示正常生理或病理过程，或是机体对于药物反应的物理、化学、生物指标。研究显示，细胞从正常状态转变为肿瘤的过程中，细胞内蛋白表达谱会发生一系列变化。肿瘤标志物就是在肿瘤发生和发展过程中，由肿瘤细胞合成释放或宿主对肿瘤反应性释放的一类物质。它们具有一定的特异性与灵敏度，可以用作诊断与治疗中的监测指标。目前，已被用于临床的肿瘤标志物还相当缺乏。各国的标志物审核标准略有不同。我国在肿瘤标志物应用方面主要还是参照美国等西方发达国家的标准。以美国为例，每年ASCO(American Society of Clinical Oncology)都会对肿瘤临床所用的生物标志物提出指导性建议。如2007年能用于乳腺癌的标志物包括ER/PR，HER2，uPA/PAIl，和多参数基因表达分析方法(Oncotype DM, MammaPrint等)，并提供了详细的建议使用条件和范围。其余的如Ki67, Cyclin D, Cyclin E, p27, p21,蛋白质组分析等因证据不充分,不被建议使用(参见ASCO网页)。可以看到，在承认这些标志物在改善病人诊断，治疗中的作用同时，目前肿瘤病人的发病率和致死率仍总体上呈上升趋势。这一现象要求更多更好的肿瘤标志物的发现和临床应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的人肿瘤标志物，具体涉及人肿瘤标志物TBRG4的多肽，该多肽包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物；其编码核酸(RNA)具有SEQ ID NO 5的序列。本专利技术的另一个目的是提供编码上述RNA，多肽的脱氧核酸序列(DNA) SEQ IDNO 6。本专利技术的另一个目的是提供上述RNA和多肽的制备方法，以及该RNA，多肽和其编码序列的用途。本专利技术中，所述的RNA可通过PCR的方式产生；具体的说,可采用SEQ ID NO 3中的引物对，通过聚合酶链式反应，获得序列为SEQ ID NO 5的RNA产物；所述多肽可通过化学合成的方式生产；该RNA和多肽均可用于帮助检测肿瘤的存在。本专利技术经试验表明，获得了新的可作为肿瘤标志物的基因；该基因的表达产物包括RNA SEQ ID NO :4和蛋白SEQ ID NO :2，所述的多核苷酸SEQ ID NO :4编码具有SEQIDN02的氨基酸序列的蛋白；所述的表达产物在正常细胞和组织中几乎检测不到，在肿瘤细胞和组织中却有很高的表达；且所述的表达量与肿瘤的级别，分化程度，及病人的预后都呈明显正相关；研究结果表明，所述的TBRG4是一特异的肿瘤标志物，在此基础上完成了本专利技术。具体的说，本专利技术通过系统地比较来自同一个患者的、不同恶性程度的乳腺癌细胞系，获得了一系列的差异表达蛋白质；所述TBRG4为其中一个新的在肿瘤中特异表达的蛋白质；通过定量PCR和免疫印迹方法，结果显示，恶性程度高的肿瘤细胞系中TBRG4的mRNA及蛋白表达水平均明显高于正常细胞系；同时，通过抗体验证发现TBRG4蛋白在肿瘤病人组织中高表达，正常组织中则表达水平很低(如图I所示)；更进一步，通过免疫组化的方法，本专利技术对62例正常及乳腺癌肿瘤患者的组织进行实验，结果表明，正常乳腺组织中未见有TBRG4蛋白的表达，而早期乳腺疾病(Hyperplasia，乳腺增生)中则显示有TBRG4的低水平表达；而其在恶性乳腺癌如浸润型导管癌及小叶癌中有着普遍的高表达；上述实验证据表明，所述的TBRG4具有作为早期检测乳腺癌标志物的潜在作用。本专利技术通过下述方法检测样品中的TBRG4，它包括抽提组织中的RNA，反转录成cDNA，用SEQ ID NO 3的引物序列定量PCR扩增；或，抽提组织中的蛋白质，用特异抗体进行免疫印记反应，检测蛋白质水平；或，对石蜡包埋的组织，用特异抗体进行免疫组化试验。所述的特异抗体是与TBRG4蛋白特异性结合的抗体。本专利技术根据TBRG4在肿瘤中的过表达，进行抑制它的表达是否能抑制肿瘤的生长检验设计合成了针对TBRG4的shRNA,并将它克隆到可诱导表达的慢病毒(lenti-viral)载体中；结果显示，抑制TBRG4的表达可显著抑制肿瘤的生长；所述结果进一步证实TBRG4能作为肿瘤治疗的靶标。在本专利技术的中，提供了模拟、促进、拈抗人TBRG4活性的化合物，以及抑制人TBRG4的表达的化合物。较佳地，该化合物是人TBRG4编码序列或其片断的小分子干扰RNA。将所述的小分子shRNA克隆到pLKO. I.载体中成pLKO. l_shTBRG4.将该载体同包装质粒共转入包装细胞293T以产生病毒。用病毒感染待测肿瘤细胞，结果显示待测肿瘤细胞的生长明显减慢。本专利技术涉及的TBRG4蛋白及其编码序列，可用于肿瘤的预防、早期检测、预后的判断，以及制备含有安全有效量的上述TBRG4蛋白拈抗剂(如抗体和反义核酸，RNAi等)及药学上可接受的载体的药物组合物。附图说明图I显示了本专利技术的TBRG4在乳腺癌细胞系和组织中的表达，其中，A :用TBRG4的特异引物进行的定量逆转录PCR，结果以对照基因GAPDH进行标准化表示，图中16N，HME为正常乳腺上皮细胞，其余为乳腺癌细胞；B :乳腺细胞中用免疫印记法检测TBRG4蛋白，细胞标识如A ；C :在正常及癌变乳腺组织样本中用免疫印迹法检测TBRG4蛋白；D :在组织芯片中用免疫组化检测TBRG4蛋白，图为正常，原位癌，和侵袭性癌的示例；上正常；中原位导管癌；下侵袭性癌。图2表明抑制TBRG4表达可显著降低乳腺癌细胞的生长速度及克隆形成能力，其中，A :使用三个TBRG4稳定抑制株细胞及相应对照进行克隆形成实验，所形成的克隆经结晶紫染色并计数；B :使用三个TBRG4稳定抑制株细胞及相应对照进行MTT实验，各细胞株每日生长趋势如左侧图所示，右侧侧免疫印迹图表示各稳定抑制细胞株中TBRG4的表达水平。图3表明抑制TBRG4表达可显著降低乳腺癌细胞的迁移速度，其中，使用三个TBRG4稳定抑制株细胞及相应对照进行细胞迁移实验，穿膜的细胞经结晶染色。具体实施例方式在本专利技术的第一方面，提供了新的分离出的差异表达的TBRG4多肽，它包含具有SEQ ID NO : I氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物。实施例I :获得差异表达的TBRG4多肽将从一个患者分离得到的乳腺癌细胞系16N(正常)，NT (原位肿瘤)和MT2(转移肿瘤)中的蛋白质用裂解液(8M urea, 2. 5M thiourea, 65mM DTT,4% (w/v) CHAPS, 0. 5%(v/v)Biolytes pH 3-10, protease inhibitor cocktail)抽提，定量(RC DC Protein本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人肿瘤标志物TBRG4多肽，其特征在于，该多肽包含：SEQ？ID？NO：1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物；其编码核酸具有SEQ？ID？NO：5的序列。

【技术特征摘要】
1.一种人肿瘤标志物TBRG4多肽，其特征在于，该多肽包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物；其编码核酸具有SEQ IDNO 5的序列。2.—种TBRG4蛋白，其特征在于，该蛋白具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列。3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO :4的序列，其编码权利要求2的蛋白。4.一种DNA，其特征在于，具有SEQ ID NO 6的结构，其编码权利要求I的RNA及多肽。5.一种化合物，其特征在于，该化合物为拈抗人TBRG4活性拈抗剂，它含有权利要求I的人TBRG4编码序列或其片断的小分子干扰RNA。6.一种药物组...

【专利技术属性】
技术研发人员：施前，张伟，徐晓恩，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：