鼠李糖诱导型启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了鼠李糖诱导型启动子及其应用。本发明专利技术首先公开了从毕赤酵母中分离的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的鼠李糖诱导型启动子。本发明专利技术还公开了含有所述鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体及宿主细胞。本发明专利技术进一步提供了一种调控目的异源性基因在毕赤酵母中进行适时、适量表达的方法，包括：用所述的鼠李糖诱导型启动子和待表达的目的异源性基因构建真核表达载体；将构建的真核表达载体转化到酵母中得到重组酵母；通过控制培养基中诱导物鼠李糖的添加量和添加时间来调控目的蛋白适时、适量的表达，实现外源蛋白表达的精确控制。

【技术实现步骤摘要】
鼠李糖诱导型启动子及其应用
本专利技术涉及启动子，尤其涉及一种从毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中分离鉴定的鼠李糖诱导型启动子，本专利技术还涉及含有该鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体及重组宿主细胞，本专利技术进一步涉及该诱导型启动子在调控外源基因在真核细胞中进行适时、适量表达等方面的应用，属于鼠李糖诱导型启动子的分离及应用领域。
技术介绍
毕赤酵母表达系统以高密度发酵、发酵工艺成熟、发酵成本低、产物易分离等优点而广泛用于外源蛋白的表达(Macauley-Patrick等人，2005，Yeast，22:249-270；Damasceno等人，2012，AppliedMicrobiologyandBiotechnology，93:31-39)。毕赤酵母利用甲醇作为唯一的碳源和能量来源时，甲醇诱导表达甲醇代谢所需的酶类如醇氧化酶(AlcoholOxidase,AOX)的含量可达到胞内蛋白的30％(韩雪清等人，2003，微生物学杂志，23：35-40)，因此AOX1启动子(PAOX1)是一个适用于外源基因高效表达的调控因子，基于PAOX1的毕赤酵母表达载体得以广泛应用。但使用这类表达系统时会存在以下两方面问题：1)在实验室小规模发酵时，涉及到繁琐的培养基置换的过程；2)在诱导表达蛋白特别是在大规模发酵时，涉及大量甲醇存放、使用等过程，因而存在较大的风险。另外，基于毕赤酵母组成型强启动子—三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PGAP)的表达载体也得以广泛应用，但这类表达系统也存在以下弊端：1)在组成型启动子的调控下，目的蛋白在整个发酵期间持续表达，因此难以实现外源蛋白表达的精确控制；2)当所表达的蛋白对宿主细胞的生长有副作用时，难以实现目的蛋白的表达。研究表明，鼠李糖可诱导与鼠李糖代谢相关酶类的表达，并且多个鼠李糖诱导型启动子被分离并应用于外源基因的表达(Cardona等人，2006，ApplEnvironMicrobiol，72：2547-2555；Fieseler等人，2012，PLoSOne，7；Wegerer等人，2008，BMCBiotechnol，14)。真核生物中，鼠李糖代谢的初始步骤中主要涉及如下四种酶：L-鼠李糖脱氢酶(L-rhamnose1-dehydrogenase)、内酯酶(lactonase)、脱水酶(dehydratase)、醛缩酶(aldolase)。研究表明，木糖发酵酵母(Scheffersomycesstipitis)中与鼠李糖代谢相关酶基因形成基因簇，并且相关基因表达受鼠李糖特异性诱导(Koivistoinen等人，2012，Gene，492:177-185)。毕赤酵母亦可利用鼠李糖为唯一碳源和能源，然而在毕赤酵母GS115染色体上仅有PAS_chr1-4_0075位点被注释为L-鼠李糖脱水酶编码基因，其它三个基因未被确定。因此，从毕赤酵母GS115染色体上鉴定分离一种鼠李糖诱导型启动子进而构建基于该鼠李糖诱导型启动子的真核表达载体，不仅可避免使用危险物甲醇，还可通过控制诱导物的添加量和添加时间来调控目的蛋白适时、适量地表达，在外源基因适度表达和基础研究方面也将具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种从毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中分离的鼠李糖诱导型启动子。本专利技术的目的之二是提供一种含有上述鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体及含有该表达载体的重组宿主细胞。本专利技术的目的之三是将所述的鼠李糖诱导型启动子以及含有该鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体应用于外源基因适度表达和基础研究等方面。本专利技术首先提供了一种从毕赤酵母GS115中分离鉴定的鼠李糖诱导型启动子，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示：(a)、SEQIDNO.1所示的多核苷酸序列；或(b)、与SEQIDNO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有鼠李糖诱导型启动子的功能；或(c)、与SEQIDNO.1的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有鼠李糖诱导型启动子的功能；优选的，其与SEQIDNO.1的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有鼠李糖诱导型启动子的功能；更优选的，其与SEQIDNO.1的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有鼠李糖诱导型启动子的功能；最优选的，其与SEQIDNO.1的多核苷酸序列至少有95％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有鼠李糖诱导型启动子的功能；或(d)、在SEQIDNO.1的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入获得的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体仍具有鼠李糖诱导型启动子的功能。本专利技术采用生物信息学分析手段，对毕赤酵母GS115染色体PAS_chr4_0338、PAS_chr4_0339和PAS_chr4_0341位点进行分析，初步预测分别为鼠李糖脱氢酶、内酯酶、醛缩酶编码基因；本专利技术进一步对基因PAS_chr4_0341及该基因启动子(P0341)(SEQIDNO.1)进行生物学功能分析，分离鉴定出一种鼠李糖诱导型启动子。具体的，本专利技术首先测定基因PAS_chr4_0341在不同碳源培养基中的转录水平，结果显示PAS_chr4_0341在毕赤酵母GS115以鼠李糖为唯一碳源的培养基中的转录水平分别为毕赤酵母GS115在以葡萄糖为唯一碳源的培养基和以葡萄糖和鼠李糖为碳源的培养基中转录水平的5400倍和13倍，这表明PAS_chr4_0341的转录受鼠李糖诱导，被葡萄糖抑制；进一步研究结果表明，在鼠李糖为唯一碳源培养基中PAS_chr4_0341的转录水平为组成型转录的三磷酸甘油醛脱氢酶基因转录水平的22％，表明基因PAS_chr4_0341的启动子(P0341)具有启动能力，可用于启动外源基因在毕赤酵母中进行适度表达。为进一步验证鼠李糖诱导型启动子P0341启动外源基因表达的强度，本专利技术以乳糖酶为报告基因，构建了鼠李糖诱导型启动子调控乳糖酶基因表达的质粒pP0341LacB及由三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PGAP)调控乳糖酶基因表达的质粒pPGAPLacB。用电击转化方法将质粒pP0341LacB及pPGAPLacB导入毕赤酵母GS115中，质粒经同源臂Gas1L和Gas1R与染色体上同源序列双交换而整合于毕赤酵母GS115染色体的Gas1位点，从而得到染色体整合由P0341及PGAP调控乳糖酶基因表达的转化子GS115-P0341LacB及GS115-PGAPLacB。测定酵母GS115-P0341LacB及GS115-PGAPLacB在不同碳源培养基中发酵液上清中乳糖酶活力。结果表明，GS115-P0341LacB只在以鼠李糖为碳源时才表达乳糖酶；而GS115-PGAPLacB在多种糖为碳源时均可表达乳糖酶。以上结果进一步表明，P0341为诱导型启动子且仅受鼠李糖诱导；另一方面在鼠李糖作为碳源时，GS115-P0341LacB发酵上清中乳糖酶的活力为GS115-PGAPLacB的22.8％，实验结果表明P0341为中等强度的启动子。本专利技术进一步提供了构建含有所述鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
从毕赤酵母(Pichia pastoris)中分离的鼠李糖诱导型启动子，其特征在于，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示：(a)、SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列；或(b)、与SEQ ID NO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有鼠李糖诱导型启动子的功能；或(c)、与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有鼠李糖诱导型启动子的功能；优选的，其与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有鼠李糖诱导型启动子的功能；更优选的，其与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有鼠李糖诱导型启动子的功能；最优选的，其与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有95％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有鼠李糖诱导型启动子的功能；或(d)、在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入获得的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体仍具有鼠李糖诱导型启动子的功能。

【技术特征摘要】
1.从毕赤酵母(Pichiapastoris)中分离的鼠李糖诱导型启动子，其特征在于，其多核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。2.一种表达盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的鼠李糖诱导型启动子和目的异源性基因。3.含有权利要求1所述鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体。4.按照权利要求2所述的表达盒或权利要求3所述的重组真核表达载体，其特征在于：所述的目的异源性基因是待研究的外源蛋白基因。5.含有权利要求3或4所述的重组真核表达载体的重组宿主细胞。6.权利要求1所述的鼠李糖诱导型启动子在调控或启动目的异源性基因表达中的用途。7.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘波，张伟，张宇宏，徐欣欣，张宇微，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11