【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及虾青素的重组表达菌株，尤其涉及表达虾青素的重组毕赤酵母菌株及其构建方法和在表达重组虾青素中的应用，属于虾青素的重组表达领域。
技术介绍
1、虾青素是一种具有极强抗氧化活性的天然化合物，主要存在于一些藻类、酵母等微生物中，其生物活性和保健功能已得到明确验证和普遍认可，目前已被广泛应用于食品营养补充剂、饲料添加剂和化妆品等行业中。虾青素的工业生产方式主要包括化工合成和从天然来源中提取。化工合成虾青素的生产过程难以完全排除化工污染，一般只允许作为饲料添加剂使用。天然虾青素主要从雨生红球藻中提取，但生产周期长，产量低，无法满足市场需求。
2、近年来，工业微生物代谢工程技术迅猛发展，已逐渐成为规模化高效合成各种高值化合物的极具潜力的替代方案。虾青素以其优良的功能活性和明确的生物合成途径，成为微生物代谢工程研究的热点之一。目前已实现虾青素在大肠杆菌、酿酒酵母和解脂耶氏酵母等工业微生物宿主中的合成，但产量仍然低于天然宿主雨生红球藻，这主要是由虾青素代谢途径和其自身的分子特性导致的。
3、虾青素合成途径中的关键酶均为膜蛋白，膜蛋白相比于可溶性蛋白，更加难以在异源宿主中正确折叠和高效表达；虾青素及其上游中间代谢物多为亲脂性化合物，主要存在于细胞内的膜结构中，造成膜压力和细胞毒性，最终限制虾青素的表达产量，有待改进。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一是提供一种提高虾青素在酵母中重组表达产量的方法；
2、本专利技术的目的之二是提供一种表达虾青素的重
3、本专利技术的目的之三是将所述的表达虾青素的重组酵母菌株应用于表达或生产虾青素。
4、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
5、将虾青素合成途径的关键编码基因在毕赤酵母中进行重组表达，同样受到虾青素脂溶性特性的影响，导致细胞内膜压力，最终导致虾青素产量偏低；本专利技术意外发现，将内质网压力响应转录因子hac1p的编码基因与虾青素合成途径的关键编码基因与在宿主酵母菌株中进行共表达能够显著提高虾青素的表达产量，由此完成了本专利技术。
6、本专利技术的一方面是提供了一种提高虾青素在酵母中重组表达产量的方法，包括：将虾青素合成途径的关键编码基因与内质网压力响应转录因子hac1p的编码基因在宿主酵母菌株中进行共表达。
7、本专利技术的另一方面是提供了一种表达虾青素的重组酵母工程菌株，其构建方法包括：
8、（1）将虾青素合成途径的关键编码基因整合到酵母基因组中构建得到表达虾青素的重组酵母菌株；
9、（2）构建表达内质网压力响应转录因子hac1p编码基因的酵母表达载体；
10、（3）将步骤（2）构建的酵母表达载体转化至步骤（1）构建的重组酵母菌株，将内质网压力响应转录因子hac1p编码基因在重组酵母菌株中进行过表达，即得。
11、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的虾青素合成途径的关键编码基因包括香叶基香叶基焦磷酸合酶（crte）编码基因、八氢番茄红素合成/番茄红素β-环化双功能酶（crtyb）编码基因、八氢番茄红素去饱和酶（crti）编码基因、β-胡萝卜素羟基化酶（crtz）编码基因和β-胡萝卜素酮酶（crtw）编码基因；为了提高虾青素合成途径的关键编码基因在宿主酵母中的表达产量，本专利技术分别将香叶基香叶基焦磷酸合酶（crte）编码基因、八氢番茄红素合成/番茄红素β-环化双功能酶（crtyb）编码基因、八氢番茄红素去饱和酶（crti）编码基因、β-胡萝卜素羟基化酶（crtz）编码基因、β-胡萝卜素酮酶（crtw）编码基因按照毕赤酵母偏好密码子进行优化，其中，优化后的香叶基香叶基焦磷酸合酶（crte）编码基因的核苷酸序列为seq id no.1所示，优化后的八氢番茄红素合成/番茄红素β-环化双功能酶（crtyb）编码基因的核苷酸序列为seq id no.2所示，优化后的八氢番茄红素去饱和酶（crti）编码基因的核苷酸序列为seq id no.3所示，优化后的β-胡萝卜素羟基化酶（crtz）编码基因的核苷酸序列为seq id no.4所示，优化后的β-胡萝卜素酮酶（crtw）编码基因的核苷酸序列为seq id no.5所示。
12、本专利技术中所述的内质网压力响应转录因子hac1p的编码基因的核苷酸序列属于现有技术中已公开的基因序列（譬如：genbank: oq326497.1）。
13、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述的酵母菌株优选为毕赤酵母菌株；毕赤酵母是工业中表达外源蛋白最常用的宿主菌株，本专利技术采用毕赤酵母作为合成虾青素的底盘菌株，主要基于毕赤酵母以下优势：（1）相比于其它工业微生物宿主，毕赤酵母具有强大的内质网蛋白质量监控系统，更加适合膜蛋白的表达和正确折叠；（2）与crabtree阳性的酿酒酵母不同，crabtree阴性的毕赤酵母在葡萄糖高密度发酵过程中，不会产生乙醇，从而不会由于乙醇的积累而影响细胞生长，同时也降低了c源的浪费；（3）毕赤酵母自身代谢途径具有更高的磷酸戊糖途径通量，可以更高效的产生nadph，nadph是虾青素合成途径和宿主自身代谢网络的竞争性辅因子；（4）毕赤酵母更适应以低成本无机盐为培养基的高密度发酵。
14、本专利技术中所述的酵母表达载体优选为毕赤酵母表达载体。
15、本专利技术的一种优选的具体实施方案，所述表达虾青素的重组酵母菌株的构建方法包括：（1）将虾青素合成途径的关键编码基因包括香叶基香叶基焦磷酸合酶（crte）编码基因、八氢番茄红素合成/番茄红素β-环化双功能酶（crtyb）编码基因、八氢番茄红素去饱和酶（crti）编码基因、β-胡萝卜素羟基化酶（crtz）编码基因和β-胡萝卜素酮酶（crtw）编码基因分别插入到组成型启动子pgap和终止子taox之间得到5个表达框；将5个表达框串联并构建到毕赤酵母表达载体中，得到携带5种基因的重组毕赤酵母表达载体；（2）将重组毕赤酵母表达载体线性化后转化至毕赤酵母gs115，筛选得到表达虾青素的重组酵母菌株。
16、本专利技术的一种优选的具体实施方案，构建表达内质网压力响应转录因子hac1p编码基因的酵母表达载体的方法包括：将hac1p编码基因构建到毕赤酵母表达载体9kz的组成型启动子ptef和终止子ttef之间，构建得到携带hac1p基因完整表达框的表达内质网压力响应转录因子hac1p编码基因的酵母表达载体。
17、本专利技术发现，相比于单独表达虾青素合成途径的关键编码基因的重组酵母菌株，将毕赤酵母内质网压力响应转录因子hac1p编码基因在表达虾青素的重组酵母菌株中与虾青素合成途径的关键编码基因进行共表达，使虾青素产量进一步提高65%，在摇瓶条件下达到48mg/l，在含有无机盐培养基的3.7l自动控制发酵罐培养条件下，虾青素产量达到380mg/l，因此，本专利技术提供的重组表达虾青素的酵母工程菌株在制备或生产虾青素上具有一定的产业化潜力。
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1.一种提高虾青素在酵母菌株中重组表达产量的方法，其特征在于，包括：将虾青素合成途径的关键编码基因与内质网压力响应转录因子HAC1p的编码基因在酵母菌株中进行共表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的虾青素合成途径的关键编码基因包括香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因、八氢番茄红素合成/番茄红素β-环化双功能酶编码基因、八氢番茄红素去饱和酶编码基因、β-胡萝卜素羟基化酶编码基因和β-胡萝卜素酮酶编码基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述八氢番茄红素合成/番茄红素β-环化双功能酶编码基因是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；所述八氢番茄红素去饱和酶编码基因是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；所述β-胡萝卜素羟基化酶编码基因是是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为SEQID No.4所示；所述β-胡萝卜素酮酶编码基因是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为SEQID No.5所示。
<...【技术特征摘要】
1.一种提高虾青素在酵母菌株中重组表达产量的方法，其特征在于，包括：将虾青素合成途径的关键编码基因与内质网压力响应转录因子hac1p的编码基因在酵母菌株中进行共表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的虾青素合成途径的关键编码基因包括香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因、八氢番茄红素合成/番茄红素β-环化双功能酶编码基因、八氢番茄红素去饱和酶编码基因、β-胡萝卜素羟基化酶编码基因和β-胡萝卜素酮酶编码基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为seq id no.1所示；所述八氢番茄红素合成/番茄红素β-环化双功能酶编码基因是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为seq id no.2所示；所述八氢番茄红素去饱和酶编码基因是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为seq id no.3所示；所述β-胡萝卜素羟基化酶编码基因是是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为seqid no.4所示；所述β-胡萝卜素酮酶编码基因是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为seqid no.5所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酵母菌株为毕赤酵母菌株。
5.一种表达虾青素的重组酵母工程菌株，其特征在于，其构建方法包括：
6.根据权利要求5所述的重组酵母工程菌株，其特征在于，所述的虾青素合成途径的关键编码基因包括香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因、八氢番茄红素合成/番茄红素β-环化双功能酶编码基因、八氢番茄红素去饱和酶编码基因、β-胡萝...
【专利技术属性】
技术研发人员：王楠，李刚强，郭文芳，刘德虎，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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