【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病毒生物检测，具体为一种用于检测番茄褐色皱纹果病毒的实时荧光定量pcr引物、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、番茄褐色皱纹果病毒(tomato brown rugosefruitvirus，tobrfv)，主要危害蔬菜作物番茄(solanum lycopersicum)和辣椒(capsicum annuuml.)，属于杆状病毒科(virgaviridae)，烟草花叶病毒属(tobamovirus)。番茄褐色皱纹果病毒为正义链单链rna病毒，基因组全长约6392nt，可编码4个蛋白，包括126kda复制酶、183kda复制酶、30kda移动蛋白和17.5kda的外壳蛋白。
2、tobrfv产生的时间短，目前还没有针对性的防治药剂和高抗性的品种面世，植株一旦受到该病毒侵染，发病率会极高，从而影响作物产量和果实质量。尤其在大棚内(或温室内)种植，如果没有对tobrfv做到及时有效的控制，很有可能会出现整棚(或整个温室)植株发病的严重情况。另外，番茄感病植株在幼苗早期通常表现为无症状。因此，早期诊断对于控制tobrfv病害的传播尤为重要。
3、目前，常用的诊断或检测方法包括血清学方法、分子生物学方法和生物学检测法。生物学检测法是通过番茄表型症状来判断是否感染发病，该方法受观察的主观性和症状产生的不确定性影响而具有一定的缺点；使用血清学方法检测tobrfv时易与烟草花叶病毒和番茄花叶病毒存在交叉反应；而分子生物学方法在敏感性和检测速度上明显提高，而且可以进行定量。其中，实时荧光定量pcr技术具有更强
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测番茄褐色皱纹果病毒的实时荧光定量pcr引物、试剂盒及其应用，本专利技术的实时荧光定量pcr引物具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点；可进行定量检测，对载毒量低的样本有较好的检出效果。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种用于检测番茄褐色皱纹果病毒的实时荧光定量的pcr引物，包括上游引物tobrfv-q1f和下游引物tobrfv-q1r，所述上游引物tobrfv-q1f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物tobrfv-q1r核苷酸序列如seq id no.2所示。
4、本专利技术还提供了一种检测番茄褐色皱纹果病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物。
5、优选地，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。
6、更优选地，所述阳性质控品为含有番茄褐色皱纹果病毒的peasy-t1载体质粒。
7、本专利技术还提供了一种番茄褐色皱纹果病毒的实时荧光定量检测方法，包括如下步骤：
8、s1、提取感病植株的总rna；
9、s2、以感病植株的总rna为模板，进行反转录合成cdna；
10、s3、以合成的cdna为模板，利用所述引物进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；
11、s4、将获得的pcr扩增产物纯化后连接至载体，转入感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒获得tobrfv质粒标准品，并按梯度稀释，制备标准曲线；
12、s5、以待测样本cdna为模板，利用上述的引物进行实时荧光定量pcr检测，根据扩增曲线和循环阈值判定待测样品是否携带tobrfv，将循环阈值代入标准曲线方程计算待测样品含毒量。
13、优选地，实时荧光定量pcr检测的反应体系包括模板0.8～1.2μl、8～12μm/l上下游引物各0.4μl、2×sybr qpcrmix 8～12μl、ddh2o 8～8.5μl，总体积20μl。
14、优选地，所述荧光定量pcr检测的反应程序为95℃30s；95℃10s，60℃30s，40个循环。
15、优选地，提取质粒后经测序无误，使用分光光度计测定其浓度，通过公式：
16、c＝a/b×6.02×1014，
17、计算出质粒拷贝数，作为tobrfv质粒标准品使用。
18、本专利技术还提供了一种所述的引物在制备检测番茄褐色皱纹果病毒产品中的应用。
19、本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：
20、本专利技术提供一种检测番茄褐色皱纹果病毒的实时荧光定量pcr引物，本专利技术基于tobrfv cp基因的保守区域设计了特异性引物，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物核苷酸序列如seq id no.2所示。本专利技术采用实时荧光定量pcr引物番茄褐色皱纹果病毒，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，对载毒量低的样本有较好的检出效果，可以检测的阳性质粒浓度1.0×103copies/μl，其灵敏度是普通pcr的100倍。本专利技术可直接用于田间tobrfv定量监测，为病害早期诊断和监测预警提供了强有力的支持。
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1.一种用于检测番茄褐色皱纹果病毒的实时荧光定量的PCR引物，其特征在于，包括上游引物ToBRFV-q1F和下游引物ToBRFV-q1R，所述上游引物ToBRFV-q1F的核苷酸序列如SEQID No.1所示，所述下游引物ToBRFV-q1R核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种检测番茄褐色皱纹果病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有番茄褐色皱纹果病毒的pEASY-T1载体质粒。
5.一种番茄褐色皱纹果病毒的实时荧光定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR检测的反应体系包括模板0.8～1.2μl、8～12μm/L上下游引物各0.4μl、2×SYBR qPCR Mix 8～12μl、ddH2O 8～8.5μl，总体积20μl。
7.根据权利要求5所述的检测方法，
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，提取质粒后经测序无误，使用分光光度计测定其浓度，通过公式：
9.权利要求1所述的引物在制备检测番茄褐色皱纹果病毒产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测番茄褐色皱纹果病毒的实时荧光定量的pcr引物，其特征在于，包括上游引物tobrfv-q1f和下游引物tobrfv-q1r，所述上游引物tobrfv-q1f的核苷酸序列如seqid no.1所示，所述下游引物tobrfv-q1r核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.一种检测番茄褐色皱纹果病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有番茄褐色皱纹果病毒的peasy-t1载体质粒。
5.一种番茄褐色皱纹果病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：李涛，王金凤，杨净云，邵权，徐贤明，李茜，
申请(专利权)人：云南农业职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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