【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程，尤其涉及一种腈水合酶突变体及其应用。
技术介绍
1、酰胺类化合物具有高极性、高稳定性和结构多样性，在药物和生物活性分子中广泛存在，也是有机合成的重要原料；其在药物合成、农业和精细化工行业具有广泛的应用，需求量大；酰胺类化合物的绿色高效合成一直是行业的研究热点。
2、在传统的化学方法中，最常见的酰胺合成路线是通过活性羧酸或其衍生物与胺偶联，在偶联试剂的作用下生成相应的酰胺。该过程的安全性以及原子经济性差，并且得到的酰胺化合物还需要繁琐的分离纯化步骤，过程经济性差。以腈水合酶(nitrile hydratase，nhase)为核心的生物酶法在催化腈类化合物水合生成酰胺类物质中广泛应用。生物催化由于反应条件温和、原子经济性高，且环境友好，是公认的绿色催化。以腈水合酶为核心的腈类物质水合生成相应的酰胺类化合物，是典型的生物酶催化反应。生物酶法生产丙烯酰胺和烟酰胺已是这两个酰胺化合物工业化生产的主要方法，目前全球生物法丙烯酰胺的年产能已近百万吨、烟酰胺的年产能也已经达到了近十万吨的规模。
3、在催化腈类化合物进行水合反应时，由于底物和产物较强的毒性往往会对酶分子产生破坏，使其发生不可逆的快速失活。反应过程中不断积累的高浓度产物丙烯酰胺对腈水合酶的抑制作用，导致目前国内工业生物催化生产丙烯酰胺的浓度一般仅为30％左右。因此，提高腈水合酶的产物耐受性，提高产物浓度，以提升过程的经济性一直是工业界所追求的。
4、通过构建具有腈水合酶催化活性的基因工程菌株，并对腈水合酶进行蛋白质工程改造可
技术实现思路
1、针对现有技术中对于具有更高耐受性和酶活性腈水合酶的需求，本专利技术针对来源于锰氧化橙单胞菌si859a(aurantimonas manganoxydans si859a)的腈水合酶(nham)，对α、β亚基的四个位点(α-r98、β-g41、β-s51、β-r55)进行迭代饱和突变，提供了多个产物耐受性显著提高的腈水合酶突变体及其对多种底物的催化作用。
2、第一方面，本专利技术提供了一种腈水合酶突变体，所述腈水合酶突变体是由seq idno.1所示氨基酸序列的第98位、seq id no.2所示氨基酸序列的第41位、第51位和第55位中的一个或多个位点进行突变得到。
3、所述腈水合酶突变体为下述中的任意一种：
4、(1)将氨基酸序列如seq id no.1所示的腈水合酶的α亚基的第98位精氨酸突变为异亮氨酸，且将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第41位甘氨酸突变为天冬氨酸；
5、(2)将氨基酸序列如seq id no.1所示的腈水合酶的α亚基的第98位精氨酸突变为缬氨酸，且将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第41位甘氨酸突变为天冬氨酸；
6、(3)将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第51号位丝氨酸突变为谷氨酸，α亚基的第98位精氨酸突变为缬氨酸；
7、(4)将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第51号位丝氨酸突变为谷氨酸，α亚基的第98位精氨酸突变为异亮氨酸；
8、(5)将氨基酸序列如seq id no.1所示的腈水合酶的α亚基的第98位精氨酸突变为缬氨酸，且将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第55号位精氨酸突变为半胱氨酸；
9、(6)将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第51号位丝氨酸突变为色氨酸，55号位精氨酸突变为半胱氨酸；
10、(7)将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第41位甘氨酸突变为天冬氨酸，51号位丝氨酸突变为色氨酸，55号位精氨酸突变为半胱氨酸；
11、(8)将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第41位甘氨酸突变为丝氨酸，51号位丝氨酸突变为色氨酸，55号位精氨酸突变为半胱氨酸；
12、(9)将氨基酸序列如seq id no.1所示的腈水合酶的α亚基的第98位精氨酸突变为异亮氨酸，且将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第41位甘氨酸突变为天冬氨酸，第51号位丝氨酸突变为缬氨酸；
13、(10)将氨基酸序列如seq id no.1所示的腈水合酶的α亚基的第98位精氨酸突变为缬氨酸，且将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第55号位精氨酸突变为半胱氨酸，第51号位丝氨酸突变为天冬酰胺；
14、(11)将氨基酸序列如seq id no.1所示的腈水合酶的α亚基的第98位精氨酸突变为甲硫氨酸，且将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第41位甘氨酸突变为天冬氨酸，51号位丝氨酸突变为色氨酸，55号位精氨酸突变为半胱氨酸；
15、(12)将氨基酸序列如seq id no.1所示的腈水合酶的α亚基的第98位精氨酸突变为异亮氨酸，且将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第41位甘氨酸突变为天冬氨酸，第51号位丝氨酸突变为色氨酸，55号位精氨酸突变为半胱氨酸；
16、(13)将氨基酸序列如seq id no.1所示的腈水合酶的α亚基的第98位精氨酸突变为亮氨酸，且将氨基酸序列如seq id no.2所示的腈水合酶的β亚基的第41位甘氨酸突变为天冬氨酸，51号位丝氨酸突变为色氨酸，55号位精氨酸突变为半胱氨酸。
17、来源于锰氧化橙单胞菌si859a(aurantimonas manganoxydans si859a)的腈水合酶nham，由α亚基、β亚基以及调控蛋白组成，其氨基酸序列如seq id no.1、no.2、no.3所示，对其进行饱和迭代突变，得到上述突变体。
18、第二方面，本专利技术提供了上述腈水合酶突变体的编码基因。
19、第三方面，本专利技术提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的基因。
20、第四方面，本专利技术提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌的宿主细胞包含如权利要求3所述的基因，或者包含如权利要求4所述的重组表达载体。
21、将编码第一方面中所述的β亚基突变的基因(seq id no.5)或编码α亚基突变的基因(seq id no.4)与调控蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种腈水合酶突变体，由α亚基、β亚基以及调控蛋白组成，其特征在于：所述腈水合酶突变体是由如SEQ ID NO.1所示α亚基的第98位、如SEQ ID NO.2所示β亚基的第41位、第51位、第55位中的多个位点进行多点突变得到。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：所述腈水合酶突变体为下述(1)～(13)中的任意一种：
3.如权利要求2所述腈水合酶突变体的编码基因。
4.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含如权利要求3所述的基因。
5.一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的宿主细胞包含如权利要求3所述的基因，或者包含如权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种酶制剂，其特征在于：包括如权利要求1或2所述的突变体。
7.如权利要求1或2任一项所述的腈水合酶突变体，或如权利要求5所述的基因工程菌，或如权利要求6所述的酶制剂在催化脂肪族或芳香族腈类化合物生产酰胺类物质中的应用，其特征在于：所述脂肪族腈类化合物包括丙烯腈、异丁腈、己二腈、2-丁烯腈，所述芳香族腈类化合物包括3-氰基吡啶、
...【技术特征摘要】
1.一种腈水合酶突变体，由α亚基、β亚基以及调控蛋白组成，其特征在于：所述腈水合酶突变体是由如seq id no.1所示α亚基的第98位、如seq id no.2所示β亚基的第41位、第51位、第55位中的多个位点进行多点突变得到。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：所述腈水合酶突变体为下述(1)～(13)中的任意一种：
3.如权利要求2所述腈水合酶突变体的编码基因。
4.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含如权利要求3所述的基因。
5.一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：李培清，陆安琦，徐瑶，
申请(专利权)人：浙江容锐科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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