【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶基因改造，尤其涉及基于n-糖基化改造的热稳定性脂肪酶突变体及其应用。
技术介绍
1、脂肪酶(ec 3.1.1.3)能催化油脂水\酯合成、转酯化、酸解等多种化学反应,被广泛地应用于化学,食品,制药和洗涤剂或生物能源工业中。米根霉来源的脂肪酶具有良好的1,3-位置特异性和催化活性,在食品、化工及生物能源等方面都有很重要的应用。
2、米根霉脂肪酶的全基因序列已经在ncbi上公布。完整的米根霉脂肪酶由26个氨基酸残基的信号肽(presequence)、97个氨基酸残基的前导肽(prosequence)以及269个氨基酸残基的成熟肽(mature rol)构成。目前，米根霉脂肪酶已成功在大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母等多种异源宿主中实现表达，其中毕赤酵母表达的脂肪酶具有活性高、产量高的特点，具有更好的应用潜力。
3、糖基化是生物体内蛋白质翻译后修饰的重要步骤，指的是蛋白质在一系列糖基化相关的酶的作用下，在内质网或高尔基体内附加上糖链的过程。巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)是一种高效的外源蛋白表达工具，其表达效果受基因特性、蛋白翻译、内质网及高尔基体中蛋白质的加工及转运等多种因素影响。n-糖基化是p.pastoris中一种常见的蛋白翻译后处理途径，许多研究表明毕赤酵母中发生的n-糖基化对重组蛋白的活性、稳定性以及分泌功能具有重要的影响。
4、据研究报道n-糖基化对p.pastoris表达蛋白的稳定性与活性等具有重要影响。nakajima等(https://doi.org/10.1016
5、在本实验室前期的研究中已经通过二硫键重构的方式获得了热稳定性提高的米根霉脂肪酶突变体prorol-4m(中国专利申请公开号：cn109468301a；以下简称4m)，但该突变体的热稳定性仍处于较低水平，适合的应用领域较为受限，因此通过n-糖基化改造的策略在现有突变体的基础上进一步提升rol的催化性能从而扩展其应用范围是十分必要的。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种基于n-糖基化改造的热稳定性脂肪酶突变体及其应用，该热稳定性脂肪酶突变体具有显著提高的酶活和热稳定性。
2、具体技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种热稳定性脂肪酶突变体(简称：脂肪酶突变体)，所述热稳定性脂肪酶突变体是由seq id no.7所示的氨基酸序列发生突变得到；所述突变的方式为：a8n(又称n8)、l59n(又称n95)、s227n(又称n227)中的一种。
4、seq id no.7：tctgacggtggtaaagttgttgctgctactactgctcaaattcaa gagtttactaagtacgctggtattgctgcaactgcttactgtagatctgttgttccaggtaacaaatgggattgtgttcaatgtcaaaagtgggttccagatggtaagattattactaccttcacctctttgttgtccgataccaatggttacgttttgagatccgataagcaaaagaccatctacttggttttcaggggtacaaactctttcagatctgctattaccgacatcgtgttcaacttctctgattacaaaccagttaagggtgctaaagttcatgctggtttcttgtcatcttacgaacaagttgttaacgactacttcccagttgtccaagaacaattgactgctcatccaacttacaaggttatcgttaccggtcattctttaggtggtgctcaagctttgttggctggtatggatctatatcaaagagagccaagattgtccccaaagaacttgtctatttttactgttggtggtccaagagttggtaatccaactttcgcttattacgtttgctctaccggtattccatttcaaagaaccgttcacaagagagatatcgttccacatttgccacctcaatctttcggtttcttacatccaggtgttgaatcctggattaagtctggtacatctaacgttcaaatctgcacctcttgcattgaaactaaggattgctctaactccatcgttccattcacctctattttggatcacttgtcttacttcggtatcaacgaaggttcttgcttg
5、进一步地，所述热稳定性脂肪酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1、seq idno.3或seq id no.5所示；
6、或者，如seq id no.1、seq id no.3或seq id no.5所示的具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的氨基酸序列。
7、seq id no.1：sdggkvvnattaqiqeftkyagiaataycrsvvpgnkwdcvqcqkw vpdgkiittftsllsdtngyvlrsdkqktiylvfrgtnsfrsaitdivfnfsdykpvkgakvhagflssyeqvvndyfpvvqeqltahptykvivtghslggaqallagmdlyqreprlspknlsiftvggprvgnptfayyvcstgipfqrtvhkrdivphlppqsfgflhpgveswiksgtsnvqictscietkdcsnsivpftsildhlsyfginegscl。
8、seq id no.3：sdggkvvaattaqiqeftkyagiaataycrsvvpgnkwdcvqcqk wvpdgkiittftsnlsdtngyvlrsdkqktiylvfrgtnsfrsaitdivfnfsdykpvkgakvhagflssyeqvvndyfpvvqeqltahptykvivtghslggaqallagmdlyqreprlspknlsiftvggprvgnptfayyvcstgipfqrtvhkrdivphlppqsfgflhpgvesw本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.热稳定性脂肪酶突变体，其特征在于，所述热稳定性脂肪酶突变体是由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列发生突变得到；所述突变的方式为：A8N、L59N、S227N中的一种。
2.如权利要求1所述的热稳定性脂肪酶突变体，其特征在于，所述热稳定性脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示；
3.一种编码权利要求2所述的热稳定性脂肪酶突变体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQID NO.4或SEQ ID NO.6所示；
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的基因。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括毕赤酵母蛋白表达载体；优选的，所述毕赤酵母蛋白表达载体包括pGAPZ、pGAPZα、pPIC9、pPIC3K、pPIC9K、pAO815或pPICZα；更优选的，所述重组表达载体为pPICZα。
7.一种基因工程菌，其特征在于，所
8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母或酿酒酵母；优选的，所述宿主细胞为毕赤酵母X33。
9.一种酶制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的转氨酶突变体。
10.如权利要求1或2任一项所述的热稳定性脂肪酶突变体，或者如权利要求7或8任一项所述的基因工程菌在油脂加工和生物柴油生产中的应用。
...【技术特征摘要】
1.热稳定性脂肪酶突变体，其特征在于，所述热稳定性脂肪酶突变体是由seq id no.7所示的氨基酸序列发生突变得到；所述突变的方式为：a8n、l59n、s227n中的一种。
2.如权利要求1所述的热稳定性脂肪酶突变体，其特征在于，所述热稳定性脂肪酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.3或seq id no.5所示；
3.一种编码权利要求2所述的热稳定性脂肪酶突变体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2、seqid no.4或seq id no.6所示；
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的基因。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李培清，陆安琦，汤海斌，
申请(专利权)人：浙江容锐科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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