【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学，具体涉及一种nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因在抗纤维化药物筛选中的应用。
技术介绍
1、纤维化(fibrosis)其主要的病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多和实质细胞减少，是一种累及多个器官、不可逆转的病理过程，可见于肺、肝、肾、心脏、皮肤等多种器官，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭。重要脏器的纤维化严重影响人类健康，目前仍是世界医学的研究热点和难题，亟需寻找疗效高、不良反应少的抗器官纤维化药物。
2、尽管不同组织和器官纤维化的致病机制复杂且不尽相同，但其基本共性形成过程是在炎症、免疫反应等各种刺激诱导下，实质细胞损伤进而坏死，刺激相应的巨噬细胞释放多种生长因子和促炎性细胞因子等，导致肌成纤维细胞激活和大量增殖，并分泌细胞因子，通过旁分泌方式再作用于巨噬细胞，肌成纤维细胞合成大量胶原蛋白等细胞外基质(extracellular matrix,ecm)成分，导致ecm过度沉积，成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，进而发展为纤维化。
3、转化生长因子-β(transforming growth factor，tgf-β)是一种多效性细胞因子，可以调节细胞生长、分化、ecm重构、内皮间质转化等。有大量研究表明，tgf-β可以促进特发性肺纤维化的发生，介导人肺泡上皮细胞发生上皮间质转化，激活间质细胞，合成ecm，为肺纤维化的发生和发展提供一个有利的微环境；tgf-β可以诱导肾间质细胞纤维化，促进细胞凋亡；tgf-β诱导肝脏星状细胞的肌成纤维细胞样特性，产生e
4、有研究表明这些器官纤维化形成的一个核心途径是还原型烟酰胺腺嘌二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，nadph)氧化酶(nadph oxidase，nox)的诱导和激活。nox家族是体内组织和器官中广泛分布的一种膜蛋白，其可通过nadph依赖的单电子将体内氧分子还原为超氧负离子，是体内发生氧化还原反应的关键酶，其主要生物学功能是生成活性氧(reactive oxygen species，ros)。ros是正常细胞代谢的产物，作为第二信使，其具有调节信号转导和基因表达等重要的生理功能。但当ros水平超过机体抗氧化能力时，就会发生氧化应激，导致器官功能障碍。越来越多证据显示，过量的nox衍生的ros与纤维化疾病之间有密切关联，尤其是nox家族中nox4在tgf-β调节的纤维化进程中起到重要作用。位于人源nox4启动子上游-3.97kb和-4.76kb序列之间的ap-1/smad结合盒是tgf-β1诱导人肺成纤维细胞nox4基因转录所必需的。tgf-β1可激活并上调nox4的表达，继而诱导机体产生大量的ros，ros过多进一步诱导促炎细胞因子释放，从而加剧炎症反应导致纤维化发生。因此，nox4可能是治疗纤维化的潜在有效靶点。
5、报告基因系统已被广泛用于药物筛选领域。报告基因(report gene)是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合，通过检测报告基因的表达产物来反应化合物对基因的表达情况。常见的报告基因包括荧光素酶(luciferase，luc)、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，cat)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)、分泌性人胎盘碱性磷酸酶(secreted alkalinephosphatase，seap)和绿色荧光蛋白(green fluoresce protein，gfp)等[16]。荧光素酶(luc)报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。萤火虫荧光素酶催化的发光反应在atp、mg2+和o2存在的条件下，虫荧光素在虫荧光素酶的催化下氧化发光，然后可进行定量检测。
6、基于以上机制，可开发一种用于筛选抗纤维化药物的高效快速的高通量筛选方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因，及含有该nox4-ap-1/smad融合启动子质粒。
2、本专利技术的另一目的是提供nox4-ap-1/smad融合启动子质粒的应用。
3、本专利技术的又一目的是提供一种筛选对nox4启动子有抑制作用的药物的方法。
4、本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
5、一种nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因，由鼠源nox4启动子-2000bp序列和其上游串联一次、两次或三次的ap-1/smad结合盒序列组成，其中nox4启动子-2000bp序列如seq id no.2所示，ap-1/smad结合盒序列如seq id no.3所示，ap-1/smad结合盒串联时左右两边分别加3bp的'cag'和2bp的'aa'。
6、作为本专利技术的一种优选，所述的nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因序列如seq id no.4、seq id no.5或seq id no.6所示。
7、一种nox4-ap-1/smad融合启动子质粒，包含所述的nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因。
8、作为本专利技术的一种优选，所述的nox4-ap-1/smad融合启动子质粒以pgl3-basic报告基因载体为出发载体。
9、所述的nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因、所述的nox4-ap-1/smad融合启动子质粒在构建抗纤维化药物筛选细胞模型中的应用。
10、所述的nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因、所述的nox4-ap-1/smad融合启动子质粒在构建以nox4为治疗靶点的药物筛选细胞模型中的应用。
11、所述的nox4-ap-1/smad融合启动子质粒在筛选对nox4启动子有抑制作用的药物中的应用。
12、一种用于筛选对nox4启动子有抑制作用的药物的细胞模型，由所述的nox4-ap-1/smad融合启动子质粒与含有内参β-gal基因的质粒共同转染细胞所得。
13、为了降低转染效率、细胞状态及数量对实验结果的影响，在进行荧光素酶报告基因实验过程中，采用一个不受调控的组成性表达的荧光素酶基因作为内部的参照。本实验选用pcmv-β-半乳糖苷酶质粒(pcmv-β-gal)(购自碧云天公司，产品编号d2806)作为内参基因使用(简称β-gal质粒)，实验中共同转染到受体细胞中。
14、一种筛选对nox4启动子有抑制作用的药物的方法，将所述的nox4-ap-1/smad融合启动子质粒转染本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种NOX4-AP-1/Smad融合启动子荧光素酶报告基因，其特征在于由鼠源NOX4启动子-2000bp序列和其上游串联一次、两次或三次的AP-1/Smad结合盒序列组成，其中NOX4启动子-2000bp序列如SEQ ID NO.2所示，AP-1/Smad结合盒序列如SEQ ID NO.3所示，AP-1/Smad结合盒串联时左右两边分别加3bp的'cag'和2bp的'aa'。
2.根据权利要求1所述的NOX4-AP-1/Smad融合启动子荧光素酶报告基因，其特征在于所述的NOX4-AP-1/Smad融合启动子荧光素酶报告基因序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
3.一种NOX4-AP-1/Smad融合启动子质粒，其特征在于包含权利要求1或2中所述的NOX4-AP-1/Smad融合启动子荧光素酶报告基因。
4.根据权利要求3所述的NOX4-AP-1/Smad融合启动子质粒，其特征在于以pGL3-basic报告基因载体为出发载体。
5.权利要求1或2所述的NOX4-AP-1/Smad融合
6.权利要求1或2所述的NOX4-AP-1/Smad融合启动子荧光素酶报告基因、权利要求3或4所述的NOX4-AP-1/Smad融合启动子质粒在构建以NOX4为治疗靶点的药物筛选细胞模型中的应用。
7.权利要求3或4所述的NOX4-AP-1/Smad融合启动子质粒在筛选对NOX4启动子有抑制作用的药物中的应用。
8.一种用于筛选对NOX4启动子有抑制作用的药物的细胞模型，其特征在于由权利要求3或4所述的NOX4-AP-1/Smad融合启动子质粒与含有内参β-gal基因的质粒共同转染细胞所得。
9.一种筛选对NOX4启动子有抑制作用的药物的方法，其特征在于将权利要求3或4所述的NOX4-AP-1/Smad融合启动子质粒转染细胞培养10～24h，向其中加入5～20ng/ml TGF-β1和候选药物培养12～24h，收集细胞裂解液进行荧光素酶活性检测，通过检测荧光素酶活性考察候选药物对NOX4启动子的抑制作用。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于TGF-β1的浓度为10ng/ml，加入TGF-β1和候选药物培养24h。
...【技术特征摘要】
1.一种nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因，其特征在于由鼠源nox4启动子-2000bp序列和其上游串联一次、两次或三次的ap-1/smad结合盒序列组成，其中nox4启动子-2000bp序列如seq id no.2所示，ap-1/smad结合盒序列如seq id no.3所示，ap-1/smad结合盒串联时左右两边分别加3bp的'cag'和2bp的'aa'。
2.根据权利要求1所述的nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因，其特征在于所述的nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因序列如seq id no.4、seq id no.5或seq id no.6所示。
3.一种nox4-ap-1/smad融合启动子质粒，其特征在于包含权利要求1或2中所述的nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因。
4.根据权利要求3所述的nox4-ap-1/smad融合启动子质粒，其特征在于以pgl3-basic报告基因载体为出发载体。
5.权利要求1或2所述的nox4-ap-1/smad融合启动子荧光素酶报告基因、权利要求3或4所述的nox4-ap-1/...
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