【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测，尤其涉及一种癌症标志物microrna-155的检测方法。
技术介绍
1、micrornas(mirnas)是一类内源性小非编码rna(18-22个核苷酸)，通过信使rna切割或翻译抑制来调节基因表达特异性mirna的表达失调，特别是那些在血清、血浆、眼泪、尿液和其他体液中表达的循环mirna，与各种人类疾病(包括癌症)有关，突出了它们作为癌症诊断、治疗和预后有价值的生物标志物的潜力。例如，mirna-155在乳腺癌的血液中高表达，而mirna-21在前列腺癌和肺癌的血清中上调。考虑到预防和早期诊断一直是对抗癌症最有希望和最有效的策略，开发新的方法来检测人体体液中的mirna是至关重要的。
2、迄今为止，聚合酶链式反应(pcr)因其简单、易用、灵敏度高而被广泛认为是最常用的扩增技术。然而，pcr面临着诸如昂贵的设备、对熟练人员的需求以及偶尔的假阴性和假阳性结果等挑战。作为pcr的替代品，等温核酸扩增技术在分子生物学中具有显著的优势。滚动循环扩增(rca)、环状链位移聚合(csdp)和重组酶聚合酶扩增(rpa)等方法在恒温下操作，消除了热循环的需要，降低了设备的复杂性和能耗许多基于等温核酸扩增技术的mirna检测方法已被用于检测体液中循环的mirna。例如，li等人开发了一种双发夹连接诱导的等温扩增策略，用于敏感检测mirna；zhang等人使用两个发夹探针构建了一种连接启动的环介导的等温扩增，用于高度特异性检测mirna；chen等人基于三个分裂g-四联体的发夹探针组装dna探针，用于检测mi
3、目前，相当一部分等温扩增方法依赖于扩增过程中产生的次级寡核苷酸产物来直接或间接地产生可检测的光学和电信号。代表性的方法包括使用扩增产生的g-四链体(g-quadruplex，g-4)，g-三链体(g-triplex，g-3)，结合特定的卟啉衍生物，如tht和n-甲基中卟啉ix，通过π-π堆叠g-四链体平面，从而发射可检测的信号。然而，在这个过程中，由于g-4和g-3通常都是由反应探针产生的，它们很有可能与它们的亲本链重新结合，形成杂交双链。这必然造成信号的显著损失，不利于信号放大。我们在此使用g-3(5'-tgggtagggcggg-3')作为功能性寡核苷酸探针元件来证明我们的预期。与g-4结构相比，g-3结构通常需要更少的g束(连续排列的g碱基)，并表现出更少的背景干扰，使其更适合应用于生物传感技术的开发。然而，亲本链与g-3的再杂交会导致其构型转换的逆转，从而导致显著的信号损失。这种情况促使我们考虑如何解决这个长期被忽视的问题。
4、策略性地，我们首次在扩增过程中使用高阶的g-3结构，即二聚体g-3(dg-3)作为信号报告单元，而不是单独的g-3，这将抑制g-3上的碱基与母链之间的再杂交，这有助于维持g-3结构，从而增强信号响应并确保优良的信号保存。该设计将有助于改进等温核酸扩增用于mirna的分析。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种microrna-155的检测方法，以解决上述技术问题。
2、本专利技术为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：
3、一种用于检测microrna-155的aphp探针，其特征在于：所述aphp探针是发卡型多功能核酸探针，该探针包括目标互补区、nt.bbvci识别序列、富c碱基区和变构回文尾部，分别负责识别靶mirna-155、形成切割位点、产生高阶的二聚体g-三链体(dg-3)结构和执行双模式的等温核酸扩增dmi-sda。
4、进一步的，所述aphp探针的核苷酸序列如seq id no.1所示，序列为：
5、tacgcgtcgcgtagctgaggacccctatcacgattagccagctacgcgta。
6、进一步的，dmi-sda的扩增过程产生大量次级寡核苷酸产物dpf，dpf发生构象变化形成高阶的dg-3结构并与染料硫黄素t(tht)结合，从而释放出显著的荧光，表明目标mirna-155的存在。
7、进一步的，所述dpf中包含两个g-3序列(5'-tgggtagggcgggaaaaaatgggtagggcggg-3')，形成的dg-3结构较为稳定，可以避免它们与aphp的重新杂交结合导致的构型转换的逆转，增强信号的保留；二聚体g-3(dg-3)结构相比单个的单聚体g-3(5'-tgggtagggcggg-3')结构，可以很好的提高其与tht结合后的荧光强度，为首次使用。
8、本专利技术的另一个目的是提供一种利用所述aphp探针检测microrna-155的方法，其特征在于：利用klenow聚合酶和nt.bbvci内切酶进行链聚合、切割和位移，在双模式等温扩增中，目标microrna触发能够形成dg-3结构的位移序列的自主产生和大量积累，增强信号的响应；该方法允许检测microrna-155，检测限低至1.06fm，此外，回文序列的独特属性，加上dpf的可重用性，引入了双模放大概念，在未来的应用中有可能扩展到其他检测技术。
9、进一步的，一种利用所述aphp探针检测microrna-155的方法，具体步骤为：
10、(1)aphp探针使用前，在90-95℃下孵育5-10分钟，然后逐渐冷却至室温，以稳定其发夹结构；
11、(2)将6μl双蒸馏水(ddh2o)、2μl的5μm aphp、2μl的5μm microrna-155(mirna-155)在35-37℃下孵育5-15分钟，促进aphp与microrna-155充分杂交，配制成10μl的混合物；
12、(3)在步骤(2)中获得的10μl混合物中加入浓度为5u/μl的片段聚合酶(klen ow)1μl、10×nebuffer 2反应缓冲液2μl、浓度为10u/μl的切刻内切酶(nt.bbvci)1μl、10×cutsmart 2μl、25mm的磷酸脱氧核苷酸(dntps)2μl并混合均匀，配制成20μl的混合物；该混合物在35-37℃下孵育25-35分钟，然后再在64-66℃下本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测MicroRNA-155的APHP探针，其特征在于：所述APHP探针是发卡型多功能核酸探针，该探针包括目标互补区、Nt.BbvCI识别序列、富C碱基区和变构回文尾部，分别负责识别靶miRNA-155、形成切割位点、产生高阶的二聚体G-三链体结构和执行双模式的等温核酸扩增DMI-SDA。
2.根据权利要求1所述的用于检测MicroRNA-155的APHP探针，其特征在于：所述APHP探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测MicroRNA-155的APHP探针，其特征在于：DMI-SDA的扩增过程产生大量次级寡核苷酸产物DPF，DPF发生构象变化形成高阶的DG-3结构并与染料硫黄素T结合，从而释放出显著的荧光，表明目标miRNA-155的存在。
4.根据权利要求3所述的用于检测MicroRNA-155的APHP探针，其特征在于：所述DPF中包含两个G-3序列，形成的DG-3结构较为稳定，可以避免它们与APHP的重新杂交结合导致的构型转换的逆转，增强信号的保留。
5.一种利用权利要
6.根据权利要求5所述的检测MicroRNA-155的方法，其特征在于：具体步骤为：
7.根据权利要求6所述的检测MicroRNA-155的方法，其特征在于：所述MicroRNA-155浓度在1fM-150pM范围内，493nm波长处的峰值荧光值F493与MicroRNA-155浓度CmiRNA-155的对数之间呈线性关系，拟合方程为F493＝173.14lgCmiRNA-155+1290.06，其中相关系数R2＝0.9932，其最低检测限LOD为1.06fM。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测microrna-155的aphp探针，其特征在于：所述aphp探针是发卡型多功能核酸探针，该探针包括目标互补区、nt.bbvci识别序列、富c碱基区和变构回文尾部，分别负责识别靶mirna-155、形成切割位点、产生高阶的二聚体g-三链体结构和执行双模式的等温核酸扩增dmi-sda。
2.根据权利要求1所述的用于检测microrna-155的aphp探针，其特征在于：所述aphp探针的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测microrna-155的aphp探针，其特征在于：dmi-sda的扩增过程产生大量次级寡核苷酸产物dpf，dpf发生构象变化形成高阶的dg-3结构并与染料硫黄素t结合，从而释放出显著的荧光，表明目标mirna-155的存在。
4.根据权利要求3所述的用于检测microrna-155的aphp探针，其特征在于：所述dpf中包含两个g-3序列，形成的d...
【专利技术属性】
技术研发人员：王旗，夏娟，李杨，张羽，张羽悦，
申请(专利权)人：阜阳师范大学，
类型：发明
国别省市：
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