【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶工程领域，特别涉及一种工程酶组合物及其制备方法、编码基因和应用。
技术介绍
1、糖原是存在于动植物细胞中的一种天然的纳米级树枝状葡聚糖(结合有少量具有重要作用的蛋白或多肽)。糖原的最小组成单元为α-d-葡萄糖，如图1所示，在体内的合成途径为：1)糖原蛋白的自我糖基化：在糖原蛋白的自催化作用下，糖原蛋白的第195位酪氨酸残基与尿苷二磷酸葡萄糖的葡萄糖残基供价结合并持续至葡萄糖链的长度接近10个葡萄糖单元，此时形成糖基化蛋白引物。2)糖原合酶(gs)的催化作用：糖原合酶将尿苷二磷酸葡萄糖的葡萄糖残基转移至糖基化蛋白引物的非还原性末端，并使他们通过α-1,4-糖苷键连接。3)糖原分支酶(be)的催化作用：糖原分支酶将上述形成的一段含有约8-12个葡萄糖残基的α-糖苷链转移到另一条α-糖苷链上，并使他们通过α-1,6-糖苷键连接。4)在gs和be的共同作用下，最终形成稳定的糖原β颗粒，其粒径在20-50nm左右。
2、糖原是生物体内合成和分解代谢循环中的重要部分，是维持血糖和细胞水合的关键物质。在体外，糖原在水中自发形成的球形纳米结构，使其既可以作为保湿剂，流变改性剂和乳化剂应用，又可以作为一些功能性物质的纳米载体。此外，糖原还可以最为激活细胞的信号分子，使组织或机体产生免疫调节增强甚至表现出抗肿瘤活性。因此，糖原的应用在食品，化妆品以及医药卫生领域有巨大的潜力。
3、目前，研究人员已通过多种酶促串联合成途径在体外制备糖原类似物(也称为：糖原状α-葡聚糖或生物糖原)，例如α-葡聚糖磷酸化酶-糖原分
技术实现思路
1、本专利技术的第一技术目的是提供一种经过定向进化，能够提高催化效率的工程酶组合物。
2、本专利技术的第二技术目的是提供一种经过定向进化，能够提高催化效率的工程酶组合物的制备方法。
3、本专利技术的第三技术目的是提供一种编码上述工程酶组合物的基因。
4、本专利技术的第四技术目的是提供一种工程酶组合物的应用。
5、本专利技术的第一技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
6、一种工程酶组合物，其包括三种酶：
7、蔗糖磷酸化酶，由seq id no.1所示的氨基酸序列及编码基因组成；
8、α葡聚糖磷酸化酶，由seq id no.2所示的氨基酸序列及编码基因组成；
9、和糖原分支酶，由seq id no.3所示的氨基酸序列及编码基因组成。
10、本专利技术的第二技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
11、一种工程酶组合物的制备方法，包括以下几个步骤：
12、1)克隆酶的基因到噬菌体展示载体，并表征噬菌体酶的催化特性；
13、2)利用随机突变的方法构建噬菌体展示酶的突变体库；
14、3)在开始选择前，对突变体库进行表征；
15、4)选择具有最优催化特性的进化酶克隆。
16、本专利技术的噬菌体衣壳蛋白中，常用于展示外源蛋白的是piii和pviii蛋白；构建突变库的方法有易错聚合酶链式反应、dna重排、简并引物pcr和简并寡核苷酸克隆等；噬菌体-酶展示库的选择方法有催化洗脱法、底物标记法、tsa亲和法和自杀底物法等。
17、本专利技术选定蔗糖磷酸化酶-α葡聚糖磷酸化酶-糖原分支酶的途径，通过噬菌体-酶展示的方法，对该途径用到的蔗糖磷酸化酶，α葡聚糖磷酸化酶和糖原分支酶进行定向进化，得到超级蔗糖磷酸化酶，超级α葡聚糖酶和超级糖原分支酶，相较于进化前的三种酶组合，超级酶的催化效率大大提高，同时改进了酶催化的反应工序和酶与底物的分离工序，使糖原类似物的体外合成效率大大提高，从而降低成本。
18、噬菌体-酶展示及酶分子的定向改造：噬菌体展示技术是利用基因重组的方法，将目标蛋白的基因重组到噬菌体衣壳蛋白的基因上，最终将目标蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面。虽然该技术最直接的应用是对特定蛋白新的结合剂(配体)的筛选，但是噬菌体展示技术也可以被用于对酶的定向进化。目的就是使现有的酶朝着新的或改进的催化特性进化。
19、作为优选，一种工程酶组合物的制备方法，具体包括：
20、(1)工程酶的定向进化
21、1.1)选择噬菌体展示载体为pcantab5e噬菌粒，辅助噬菌体为m13ko7；
22、1.2)确定三种酶的氨基酸序列及编码基因如下：
23、蔗糖磷酸化酶，由seq id no.1所示的氨基酸序列及编码基因组成；
24、α葡聚糖磷酸化酶，由seq id no.2所示的氨基酸序列及编码基因组成；和糖原分支酶，由seq id no.3所示的氨基酸序列及编码基因组成；
25、1.3)设计用于易错聚合酶链式反应的引物序列；
26、1.4)采用易错聚合酶链式反应的方法分别对三种酶的dna序列进行扩增；
27、1.5)将扩增好的目的dna导入载体噬菌粒(包括目的dna和载体噬菌粒的酶切、酶切后片段的重新连接)；
28、1.6)载体噬菌粒和辅助噬菌体共转化大肠杆菌；
29、1.7)挑选一定数量的单克隆分别扩大培养；
30、1.8)分别对扩大培养的每个单克隆噬菌体展示酶的催化活性进行表征；
31、1.9)选取最优进化的酶。
32、本专利技术重点是将三种普通的酶用噬菌体展示的方法定向进化后，得到催化活性大大提高的三种超级酶，再用这三种超级酶在体外合成糖原类似物。并且，由于酶是在噬菌体表面展示的，可以理解为一种酶固定化的方法，在后续催化反应结束的时候，可以用peg将噬菌体-酶沉淀分离，即简化了产物分离过程，又使酶可以重复利用，降低成本。
33、作为优选，工程酶组合物的制备方法具体包括：
34、(1)工程酶的定向进化
35、1.1)选择噬菌体展示载体为pcantab5e噬菌粒，辅助噬菌体为m13ko7；1.2)确定三种酶的氨基酸序列及编码基因如下：
36、蔗糖磷酸化酶--
37、
38、
39、α葡聚糖磷酸化酶--
40、
41、糖原分支酶--
42、
43、(2)采用易错聚合酶链式反应(error-prone pcr)的方法分别对三种酶的dna序列进行扩增。
44、作为优选，采用易错聚合酶链式反应(error-prone pcr)的方法分别对三种酶的dna序列进行扩增，具体如下：
45、①采用taqdna聚合酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程酶组合物，其特征在于包括三种酶：
2.一种工程酶组合物的制备方法，其特征在于包括以下几个步骤：
3.根据权利要求2所述的一种工程酶组合物的制备方法，其特征在于具体包括：
4.根据权利要求3所述的一种工程酶组合物的制备方法，其特征在于：采用易错聚合酶链式反应的方法分别对三种酶的DNA序列进行扩增的方法包括：
5.根据权利要求4所述的一种工程酶组合物的制备方法，其特征在于：扩增反应完成后，分别收集三种酶的扩增片段，将同一种酶的不同次数的扩增片段混合在一起。
6.根据权利要求4所述的一种工程酶组合物的制备方法，其特征在于设计引物序列如下：
7.一种编码权利要求1或2所述工程酶组合物的或权利要求3-6任一项所述的一种工程酶组合物的制备方法制备的工程酶组合物的基因。
8.根据权利要求7所述的编码所述工程酶组合物的基因，其特征在于核苷酸序列包括：
9.一种工程酶组合物的应用，其特征在于用于体外合成糖原类似物。
10.根据权利要求9所述的一种工程酶组合物的应用，其特征在于：<...
【技术特征摘要】
1.一种工程酶组合物，其特征在于包括三种酶：
2.一种工程酶组合物的制备方法，其特征在于包括以下几个步骤：
3.根据权利要求2所述的一种工程酶组合物的制备方法，其特征在于具体包括：
4.根据权利要求3所述的一种工程酶组合物的制备方法，其特征在于：采用易错聚合酶链式反应的方法分别对三种酶的dna序列进行扩增的方法包括：
5.根据权利要求4所述的一种工程酶组合物的制备方法，其特征在于：扩增反应完成后，分别收集三种酶的扩增片段，将同一种酶的不同次数的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，刘冠静，
申请(专利权)人：湖州蔻婷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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