【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物免疫，涉及犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒的pcr检测引物、探针及其应用，特别涉及一种用于犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒的三重实时荧光定量pcr检测的引物探针组合物及其检测方法和应用。
技术介绍
1、犬瘟热病毒(cdv)及犬细小病毒(cpv)是目前危害犬的2种主要病原体，二者具有高度接触传播性。cdv属于副黏病毒科、麻疹病毒属，为单股负链不分节的rna病毒，主要引起发病犬出现双相热、结膜炎、白细胞减少、支气管及肺炎、中枢神经系统损害等临床表现。犬细小病毒为单链dna病毒，在全球范围内广泛分布，能够引起典型出血性肠炎，在犬中传染性及致病性较强。犬冠状病毒(ccov)属于尼多病毒目、冠状病毒科、a-冠状病毒属为单股正链rna病毒，在犬群中具有发病率高、病死率低的特点，但幼犬感染后病死率较高。临床腹泻病例中常发生cpv与ccov混合感染，同时，cdv感染犬时会引起全身性的免疫抑制现象，犬只在发生3种病毒混合感染时的存活率较低。临床上，常规的诊断方法如病毒分离、血清学诊断方法等存在着耗时长、敏感度低的缺点，已不能满足现实临床诊断需要。目前兽医诊所使用的胶体金快速诊断盒，生产厂家众多，产品质量参差不齐，敏感性和准确性均不确实。pcr是目前使用最多且可靠性较强的实验室诊断检测方法，通过设计引物对病毒核酸进行检测从而确定有无病毒感染，但是传统的pcr方法检测灵敏度较低，为了弥补这一缺陷，后续又出现了荧光定量pcr技术。荧光定量pcr具有快速、敏感、特异等优点，在病原的特异性检测方面表现出明显的优势。近年来虽然也有一些关
技术实现思路
1、基于此，本研究针对cdv、cpv和ccov设计多对特异性引物和taq man探针，建立一种可以同时鉴别和检测三种病毒的三重荧光定量pcr方法，为临床上犬科动物疫病诊断和防控提供了可靠技术手段。
2、基于上述研究，本专利技术的目的在于提供一种用于犬瘟热病毒(cdv)、犬细小病毒(cpv)和犬冠状病毒(ccov)三重荧光定量pcr检测的引物探针组合物及其检测方法和应用。
3、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
4、一种用于cdv、cpv和ccov三重荧光定量pcr检测的引物及探针组合物，由下述1)-3)所示的引物和探针组成：
5、1)检测犬瘟热病毒的引物和探针：
6、a1.引物序列：
7、上游引物cdv-f：5′-tagatccaggactcggcgat-3′(序列1)；
8、下游引物cdv-r：5′-gtagtgcgcccaacacctaa-3′(序列2)；
9、b1.探针序列：
10、探针cdv-p：5′-atcgaaaagatgaatgtttcatgt-3′(序列3)；
11、2)检测犬细小病毒的引物和探针：
12、a2.引物序列：
13、上游引物cpv-f：5′-tggaaaggatgttcgctgga-3′(序列4)；
14、下游引物cpv-r：5′-gcgaggctatcaacttccga-3′(序列5)；
15、b2.探针序列：
16、探针cpv-p：5′-aacaactataccaaaccaattca-3′(序列6)；
17、3)检测犬冠状病毒的引物和探针：
18、a3.引物序列：
19、上游引物ccov-f：5′-gctatcgcatggtgaagggt-3′(序列7)；
20、下游引物ccov-r：5′-ggcaacccagacaactccat-3′(序列8)；
21、b3.探针序列：
22、探针ccov-p：5′-tcagcgtaaagagcttcctgaaaggt-3′(序列9)。
23、其中，所述组合物中，探针的5′端和/或3′端携带有荧光标记，所述应该标记为fam，bhq1，tamra，bhq2或vic，bhq1。
24、上述的引物及探针组合物在cdv、cpv和ccov三重荧光定量pcr检测或制备用于cdv、cpv和ccov三重荧光定量pcr检测的试剂盒中的应用也属于本专利技术的保护范围。
25、本专利技术还提供一种cdv、cpv和ccov三重荧光定量pcr检测的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物及探针组合物。
26、优选的，该试剂盒中还含有pcr技术常用试剂。
27、在本专利技术的一个实施方式中，所述试剂盒包括tagman 2×qpcr-mix预混液10μl、浓度为10μmol/l的上游引物cdv-f、浓度为10μmol/l的下游引物cdv-r各0.4μl，浓度为10μmol/l的上游引物cpv-f、浓度为10μmol/l的下游引物cpv-r、浓度为10μmol/l的上游引物ccov-f、浓度为10μmol/l的下游引物ccov-r各0.6μl；浓度为10μmol/l的探针cdv-p、浓度为10μmol/l的探针cpv-p、浓度为10μmol/l的探针ccov-p各0.3μl；rox reference dye ii(50×)0.4μl；模板2μl；rnase-free水3.5μl；其中，浓度为10μmol/l的上游引物cdv-f、浓度为10μmol/l的下游引物cdv-r、浓度为10μmol/l的上游引物cpv-f、浓度为10μmol/l的下游引物cpv-r、浓度为10μmol/l的上游引物ccov-p-f、浓度为10μmol/l的下游引物ccov-p-r、浓度为10μmol/l的探针cdv-p、浓度为10μmol/l的探针cpv-p、浓度为10μmol/l的探针ccov-p的体积比例为4：4：6：6：6：6：3：3：3。
28、上述的试剂盒在cdv、cpv和ccov三重荧光定量pcr检测中的应用也属于本专利技术的保护范围。
29、更进一步的，本专利技术提供一种cdv、cpv和ccov三重荧光定量pcr检测方法，以待测样品的dna或cdna为模板，采用上述的引物及探针组合物进行cdv、cpv和ccov三重荧光定量pcr扩增，根据ct值判断cdv、cpv和ccov的检测结果。
30、作为一种优选技术方案，所述cdv的ct值≤37为阳性，37＜ct值＜38为可疑，ct值≥38为阴性；cpv的ct值≤36为阳性，36＜ct值＜38为可疑，ct值≥38为阴性；ccov的ct值≤37为阳性，37＜ct值＜38为可疑，ct值≥38为阴性。
31、作为一种优选技术方案，所述cdv、cpv和ccov三重荧光定量pcr扩增的反应条件为：预变性95℃2min；变性95℃10s，退火和延伸60℃30s，40个循环。
32、作为一种优选技术方案，所述cdv本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒三重荧光定量PCR检测的引物及探针组合物，其特征在于，引物及探针组合物由下述1)-3)所示的引物和探针组成：
2.根据权利要求1所述的引物及探针组合物，其特征在于，所述组合物中，探针的5′端和/或3′端携带有荧光标记，所述荧光标记为FAM，BHQ1，TAMRA，BHQ2，VIC或BHQ1。
3.权利要求1或所述的引物及探针组合物在CDV、CPV和CCoV三重荧光定量PCR检测或制备用于CDV、CPV和CCoV三重荧光定量PCR检测的试剂盒中的应用。
4.一种CDV、CPV和CCoV三重荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1或2所述的引物及探针组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有PCR技术常用试剂。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Tag Man 2×qPCR-Mix预混液10μL、浓度为10μmol/L的上游引物CDV-F、浓度为10μmol/L的下游引物CDV-R各0.4μL，浓度为10μm
7.权利要求4-6中任意一项所述的试剂盒在CDV、CPV和CCoV三重荧光定量PCR检测中的应用。
8.一种CDV、CPV和CCoV三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，以待测样品的DNA或cDNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物及探针组合物进行CDV、CPV和CCoV三重荧光定量PCR扩增，根据Ct值判断CDV、CPV和CCoV的检测结果。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，CDV的Ct值≤37为阳性，37＜Ct值＜38为可疑，Ct值≥38为阴性；CPV的Ct值≤36为阳性，36＜Ct值＜38为可疑，Ct值≥38为阴性；CCoV的Ct值≤37为阳性，37＜Ct值＜38为可疑，Ct值≥38为阴性。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CDV、CPV和CCoV三重荧光定量PCR扩增的反应条件为：预变性95℃2min；变性95℃10s，退火和延伸60℃30s，40个循环；
...【技术特征摘要】
1.一种用于犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒三重荧光定量pcr检测的引物及探针组合物，其特征在于，引物及探针组合物由下述1)-3)所示的引物和探针组成：
2.根据权利要求1所述的引物及探针组合物，其特征在于，所述组合物中，探针的5′端和/或3′端携带有荧光标记，所述荧光标记为fam，bhq1，tamra，bhq2，vic或bhq1。
3.权利要求1或所述的引物及探针组合物在cdv、cpv和ccov三重荧光定量pcr检测或制备用于cdv、cpv和ccov三重荧光定量pcr检测的试剂盒中的应用。
4.一种cdv、cpv和ccov三重荧光定量pcr检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1或2所述的引物及探针组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有pcr技术常用试剂。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括tag man 2×qpcr-mix预混液10μl、浓度为10μmol/l的上游引物cdv-f、浓度为10μmol/l的下游引物cdv-r各0.4μl，浓度为10μmol/l的上游引物cpv-f、浓度为10μmol/l的下游引物cpv-r、浓度为10μmol/l的上游引物ccov-f、浓度为10μmol/l的下游引物ccov-r各0.6μl；浓度为10μmol/l的探针cdv-p、浓度为10μmol/l的探针cpv-p、浓度为10μmol/l的探针ccov-p各0.3μl；roxreference dye ii(50×)0....
【专利技术属性】
技术研发人员：陈登金，张蕾，吕云杨，宋芳，董春娜，张漫，肖进，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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