本发明专利技术公开了一种提高α‑L‑鼠李糖苷酶r‑Rha1热稳定性的方法。以原始型α‑L‑鼠李糖苷酶r‑Rha1（WT）基因为模板，采用易错PCR方法进行随机突变，构建该酶的突变文库，并建立了96孔板诱导表达及高通量筛选方法，最终获得了热稳定性提高的突变体。V529A突变体对试验使用的金属离子及效应物都具有与WT同样的耐受性。该突变体V529A具有优良的酶学性质，同时本发明专利技术也成功地构建了含上述突变体V529A的重组载体，实现了异源表达，为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和酶工程的
，尤其涉及一种提高α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1热稳定性的方法。
技术介绍
α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC 3.2.1.40))属于转化糖苷水解酶类，能够专一、高效地水解许多糖苷类物质如柚皮苷(naringin)、芦丁(rutin)、橘皮苷(hesperidin)等末端的α-L-鼠李糖基。CAZy(http://www.cazy.org/)数据库中糖苷水解酶的分类依据是其氨基酸序列的相似性，α-L-鼠李糖苷酶包含在四个糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase family,GH)，分别是GH13、GH28、GH78和GH106。α-L-鼠李糖苷酶的来源非常广泛，已有动物组织、植物组织和微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶的报道。目前关于动物组织和植物组织来源的α-L-鼠李糖苷酶的报道相对较少，主要是通过芽孢杆菌、拟杆菌、乳杆菌、链霉菌、单胞菌等细菌和黑曲霉、白曲霉、棘孢曲霉、土曲霉、青霉、木霉、酵母、犁头霉等真菌发酵来获取α-L-鼠李糖苷酶。由于黑曲霉是重要的酶制剂生产菌种，其具有重要的糖苷水解酶合成能力，并且是美国食品药品监督管理局允许使用的食品用酶生产菌，本实验采用基因工程技术手段对从原始菌株黑曲霉JMU-TS528中克隆得到的α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1进行定向进化。作为一种重要的工业酶类，α-L-鼠李糖苷酶在饮料加工行业和药物制备行业具有重要的应用价值。例如：在饮料加工行业，该酶可用于对柑橘类果汁进行脱苦处理和澄清处理，消除橙汁中的橘皮苷晶体，增加葡萄酒的香气，提高芦笋汁的抗氧化活性；在药物制备行业，α-L-鼠李糖苷酶可以用来制备具有抗炎和抗病毒的作用的普鲁宁。在工业生产中，蛋白质热稳定性越高，其应用价值和潜在优势越大。由于大部分天然α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性都存在一定的缺陷，建立一个高效的分子改造的方法提高其热稳定性是极其必要的，为将来开发更多功能，更优质的酶打下坚实的理论及实验基础。有鉴于此，本专利技术人研究和设计了一种提高α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1热稳定性的方法，本案由此产生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种热稳定性提高的α-L-鼠李糖苷酶，该α-L-鼠李糖苷酶可用于饮料加工行业和药物制备行业。为了实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采取的技术方案是：一种编码α-L-鼠李糖苷酶V529A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基因大小为1 968bp。一种α-L-鼠李糖苷酶V529A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该蛋白编码655个氨基酸残基。一种α-L-鼠李糖苷酶表达载体，含有所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A基因的表达载体pPIC9k-V529A。一种重组α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组α-L-鼠李糖苷酶V529A。作为实施例的优选方式，所述的寄主细胞为毕赤酵母。作为实施例的优选方式，包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶V529A表达载体转化至寄主细胞毕赤酵母GS115，经甲醇诱导，得到可溶性表达的重组α-L-鼠李糖苷酶V529A。作为实施例的优选方式，所述的甲醇终浓度为0.5％，诱导温度为30℃。作为实施例的优选方式，α-L-鼠李糖苷酶V529A催化水解的温度范围为30℃～80℃，最适温度为60℃；所述的水解pH范围为3.0～10.0，最适pH为5.0。最适温度及最适pH与WT一致。以pNPR为底物，分别将WT及V529A分别放置在60℃，65℃，70℃下进行热处理，其中，60℃下每2h取样测定残余酶活，65℃下每15min取样测定残余酶活，70℃下每2min取样测定残余酶活，上述酶反应在其他反应条件固定的情况下测定。初始酶活为没有经过热处理的酶液测定的酶活。结果显示，60℃下V529A的热稳定性比WT提高了1.92h；65℃下V529A的热稳定性比WT提高了25min；70℃下V529A的热稳定性比WT提高了2min。V529A对试验使用的金属离子及效应物都具有与WT同样的耐受性。本专利技术通过易错PCR随机突变的方法得到一株α-L-鼠李糖苷酶热稳定性提高的突变体V529A，发现了该突变体具有优良的酶学特性，可应用于饮料加工行业和药物制备行业。同时，本次专利技术也克隆得到了可以大量表达的工程菌，可实现该热稳定性提高的α-L-鼠李糖苷酶的规模化生产，为后续的工业化应用提供了良好的基础。附图说明图1为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的SDS-PAGE图。其中，M：分子量标准蛋白；1：纯化后的WT；2：纯化后的V529A；图2为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在60℃时的热稳定性曲线图；图3为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在65℃时的热稳定性曲线图；图4为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A在70℃时的热稳定性曲线图；图5为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的最适反应温度曲线图；图6为α-L-鼠李糖苷酶WT及V529A的最适反应pH曲线图；图7为α-L-鼠李糖苷酶WT的pH稳定性曲线图；图8为α-L-鼠李糖苷酶V529A的pH稳定性曲线图。具体实施方式实施例1：α-L-鼠李糖苷酶基因的获取接种含有WT(pPIC9K-rha)质粒的大肠杆菌DH5α于含有1mg/mL氨苄抗性的30mL LB液体培养基中37℃培养16h。使用质粒小提取试剂盒(Takara公司)按说明提取WT(pPIC9K-rha)质粒。采用EcoR I及Bln I双酶切验证。验证结果正确后作为易错PCR的模板。实施例2：α-L-鼠李糖苷酶突变库的构建及筛选将WT基因进行易错PCR，建立突变库，96微孔板对该酶进行诱导表达，经过筛选，获得了热稳性显著提高的突变体。采用WT(KC750908.1)基因，设计一对特异性引物：上游引物Q9KF(SEQ ID NO.3)：5′-CCGGAATTCGTACCCTACGAGGAGTACATTCTAG-3′，下游引物Q9KR(SEQ ID NO.4)：5′-CGCCCTAGGTTACACATTCAACCGCCATTTC-3′；PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2.5min，35循环后，72℃延伸7min。使用Takara公司PCR产物柱式回收试剂盒对PCR产物进行纯化。采用酶切克隆的方法构建重组表达质粒，即用EcoRI和BlnI双酶切易错PCR产物，割胶回收酶切后的片段与同样经EcoRI和BlnI双酶切的质粒pPIC9K进行连接，采用CaCl2转化法转化至E.coli DH5α中。从氨苄抗性筛选平板挑取单菌落进行菌落PCR鉴定含α-L-鼠李糖苷酶的重组质粒，提取PCR阳性菌落的质粒进行测序，验证阳性克隆率及库容量。将PCR验证正确的pPIC9K-rhaep的阳性克隆子提取质粒并使用SalI将所提质粒线性化，采用电击转化法转化至毕赤酵母GS115中，涂于MD平板中30℃培养直至长出单菌落，将所有单菌落分别进行保种并用96孔板进行诱导表达及筛选。将其诱导表达后的酶液在65℃下进行热处理，筛选得到1株热稳定性提高的突变体，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码α‑L‑鼠李糖苷酶V529A的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种编码α-L-鼠李糖苷酶V529A的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种α-L-鼠李糖苷酶V529A，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种α-L-鼠李糖苷酶表达载体，其特征在于：含有权利要求1所述的编码α-L-鼠李糖苷酶V529A的基因的表达载体pPIC9k-V529A。4.一种α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，其特征在于：包括采用权利要求3所述的α-L-鼠李糖苷酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得α-L-鼠李糖苷酶V529A。5.根据权利要求4所述的一种α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，其特征在于：所述的寄主细胞为毕赤酵母。6.根据权利要求5所述的一种α-L-鼠李糖苷酶V529A的制备方法，其特征在于：包括采用所述的α-L-鼠李糖苷酶表达载体转化至寄主细胞毕赤酵母GS115，经甲醇诱导，得到可溶性表达的重组α-L-鼠李糖苷酶。7.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：李利君，吴喆瑜，倪辉，杨远帆，于越，朱艳冰，姜泽东，肖安风，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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