一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，涉及胞外多糖。从保种的MRS固体培养基上选取单菌落接至MRS液体培养基中培养得已活化的发酵液；在MRS液体培养基中添加终浓度为10mM的CaCl2，取已活化的发酵液进行转接，得转接后的发酵液，取培养0，2，4，6，12，24h的1ml转接后的发酵液测定OD600、pH值；取中转接后的发酵液，除去细胞与蛋白之后，加入冰乙醇，冰箱里过夜，离心，去除上清留沉淀，将沉淀冷冻干燥后取出，透析，再冷冻干燥后即得粗胞外多糖，然后溶解于纯水中，取经过透析冻干后的粗胞外多糖样品溶于蒸馏水中，配制20mg/mL的溶液，离心，取上清液离子柱层析得鼠李糖乳杆菌胞外多糖。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及胞外多糖，尤其是涉及一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法。
技术介绍
益生菌应用有着悠久的历史。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群的平衡，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌和腐败产物的产生，制造营养物质，从而对机体的营养状态、生理功能、免疫反应等产生作用[1]。乳酸，是乳酸菌的主要的发酵产物，乳酸不但风味待殊，并有极强的杀菌力，在有机酸中一枝独秀。它杀菌能力大于柠檬酸，酒石酸，琥珀酸几倍[2]。乳酸还是一个极具吸引力的化学工业前体物，它可以作为生产可生物降解的聚丙交酯前体，和替代从石化衍生的聚合物的潜力。乳酸菌还可以将废生物质转换成工业具有工业价值的产物。活性乳酸菌饮料是一种含有活乳酸菌的发酵乳饮料。与凝固型酸奶相比，活性乳酸菌饮料不仅具有酸奶的保健功能，而且浓度更低，流动性更好，口感更爽，成本更低，所以一经问世，便迅速占领市场[3-7]。2006年全球的发酵乳饮料市场增长了9.3％，大大超过了其他乳制品的增长率。活性乳酸菌饮料的口感风味和乳酸菌的数量是构成产品质量的主要因素。研究表明[8]，益生菌在人体中的存活和增殖能力对益生菌的益生作用有着重要影响，要获得所期望的益生菌的保健功效，益生菌必须达到足够数量。我国国家标准对乳酸菌乳饮料中的活菌数规定:乳酸菌数≥106个/ml。日本发酵乳与乳酸菌饮料协会规定：乳中益生菌数至少为107个/ml，以确保进入人体后足够的活菌发挥保健功能。然而，目前许多研究发现，进入货架上的产品中益生菌的数量，会由于自身的生长特性及周围环境因素的影响，呈一定的下降趋势。因此，要获得所期望的保健效果，必须提高食品中乳酸菌的数量，以确保乳酸菌通过消化道后仍大量存活，进入肠道后发挥益生作用。但目前主要的手段都是通过活性乳酸菌乳饮料发酵工艺的优化，步骤繁琐。乳酸菌胞外多糖(EPS)是乳酸菌在其生长、代谢过程中分泌到细胞外的粘液或荚膜多糖，具有重要的物理化学特性，如良好的流变学特性，能改善发酵乳的粘度、质构和口感，防止缩水和乳清析出，使产品增稠、稳定，质地细腻均匀，口感润滑；而且EPS还具有良好的生理活性，如抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗溃疡、抗氧化、降胆固醇、降血压等，还可作为益生元促进肠道内其他益生菌的生长，调节肠道菌群[9-11]。近年来关于乳酸菌和乳酸菌胞外多糖的研究成为热点。参考文献：[1]E,Alvarez S,Medina M,et al.Gut mucosal immunostimulation by lactic acid bacteria[J].Biocell,2000,24(3):223-232.[2]甄光明,张杰.生物降解塑料聚乳酸及其工业应用[J].新材料产业,2009,(8):36-41.[3]汪芳安.乳酸菌发酵营养保健及其食品开发[J].西部粮油科技,1995,(3):36-37.[4]张延利,唐秀敏.酸奶的营养价值与保健功能[J].食品科技,1997,(4):38-40.[5]董开发,徐明生.酸奶的营养保健作用[J].中国食物与营养,2000,(2):33-34[6]Ahme S,Nobaek S,Jeppsson B,et al.The normalLactibacillus flora of healthy human rectal and oral mucosa[J].Journal of Applied Microbiology,1998,85(1):88-94.[7]Hosoda M,Hashimoto H,He F,et al.Effect of administration of milk Fermented with Lactobacillus acidophilus LA-2 on fecal mutagenicity and microflora in the human Intestine[J].Journal of Dairy Science,1995,79(5):45-749.[8]宋昆冈.乳酸菌乳饮料国内外发展趋势[J].食品工业科技,2005,(7):10-11.[9]Wei C,Zhao Z,Shi-Fei C,et al.Optimization for the production of exopolysaccharide from Fomes fomentarius in submerged culture and its antitumor effect in vitro[J].Bioresource Technology,2008,99(8):3187-3194.[10]Xu R,Nan S,Li P.Invitro and invivo antioxidant activity of exopolysaccharide fractions from Bifidobacterium animalis RH[J].Anaerobe,2011,17(5):226-231.[11]Matés J M.Effects of antioxidant enzymes in the molecular control of reactive oxygen species toxicology[J].Toxicology,2000,153(1-3):83-104.
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法。本专利技术包括以下步骤：1)从保种的MRS固体培养基上选取单菌落接至MRS液体培养基中培养，得已活化的发酵液；在步骤1)中，所述菌种为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，该菌株购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述MRS固体培养基的组成为：葡萄糖20g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸铵1g/L，乙酸钠5g/L，KH2PO4 2g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L,MnSO4·H2O 0.05g/L，琼脂粉15g/L，pH 6～6.5；所述MRS液体培养基的组成为：葡萄糖20g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸铵1g/L，乙酸钠5g/L，KH2PO4 2g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L,MnSO4·H2O 0.05g/L，pH 6～6.5，灭菌条件为118℃，15min；所述培养的条件可在37℃下恒温静置培养12h；2)在MRS液体培养基中添加终浓度为10mM的CaCl2，取步骤1)中已活化的发酵液进行转接，得转接后的发酵液，取培养0，2，4，6，12，24h的1ml转接后的发酵液测定OD600、pH值；在步骤2)中，所述转接按体积百分比4％进行转接。3)取步骤2)中转接后的发酵液，除去细胞与蛋白之后，按体积比1∶3加入冰乙醇，冰箱里过夜，然后离心，去除上清留沉淀，将沉淀冷冻干燥后取出，透析，再冷冻干燥后，即得粗胞外多糖(c-EPS)；在步骤3)中，所述冰乙醇可采用质量百分浓度为95％的冰乙醇；所述冰箱的温度可为4℃；所述离心的条件可在4℃，8000g离心10min；所述冷冻干燥的时间可为8h；所述透析的条件本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于包括以下步骤：1)从保种的MRS固体培养基上选取单菌落接至MRS液体培养基中培养，得已活化的发酵液；2)在MRS液体培养基中添加终浓度为10mM的CaCl2，取步骤1)中已活化的发酵液进行转接，得转接后的发酵液，取培养0，2，4，6，12，24h的1ml转接后的发酵液测定OD600、pH值；3)取步骤2)中转接后的发酵液，除去细胞与蛋白之后，按体积比1∶3加入冰乙醇，冰箱里过夜，然后离心，去除上清留沉淀，将沉淀冷冻干燥后取出，透析，再冷冻干燥后，即得粗胞外多糖；4)将步骤3)所得的粗胞外多糖溶解于纯水中，取经过透析冻干后的粗胞外多糖样品，溶于蒸馏水中，配制20mg/mL的溶液，离心，取上清液离子柱层析，得鼠李糖乳杆菌胞外多糖。
【技术特征摘要】
1.一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于包括以下步骤：1)从保种的MRS固体培养基上选取单菌落接至MRS液体培养基中培养，得已活化的发酵液；2)在MRS液体培养基中添加终浓度为10mM的CaCl2，取步骤1)中已活化的发酵液进行转接，得转接后的发酵液，取培养0，2，4，6，12，24h的1ml转接后的发酵液测定OD600、pH值；3)取步骤2)中转接后的发酵液，除去细胞与蛋白之后，按体积比1∶3加入冰乙醇，冰箱里过夜，然后离心，去除上清留沉淀，将沉淀冷冻干燥后取出，透析，再冷冻干燥后，即得粗胞外多糖；4)将步骤3)所得的粗胞外多糖溶解于纯水中，取经过透析冻干后的粗胞外多糖样品，溶于蒸馏水中，配制20mg/mL的溶液，离心，取上清液离子柱层析，得鼠李糖乳杆菌胞外多糖。2.如权利要求1所述一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于在步骤1)中，所述MRS固体培养基的组成为：葡萄糖20g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，柠檬酸铵1g/L，乙酸钠5g/L，KH2PO4 2g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L,MnSO4·H2O 0.05g/L，琼脂粉15g/L，pH 6～6.5。3.如权利要求1所述一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的提纯方法，其特征在于在步骤1)中，所述MRS液体培养基的组成为：葡萄糖20g/L，牛肉膏1...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢英华，薛成凤，吴意珣，凌雪萍，敬科举，姚传义，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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