人血型抗原P1五糖的合成方法技术

本发明专利技术公开了一种人血型抗原P1五糖的合成方法，包括：利用“一锅多酶”体系将半乳糖以β1‑4糖苷键偶联到式(III)所示的三糖上，合成式(IV)所示的四糖的步骤；以及利用“一锅多酶”体系将半乳糖以α1‑4糖苷键偶联到式(IV)所示的四糖上，合成式(I)所示的五糖的步骤；式(I)、式(III)和式(IV)中，R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α‑或β‑构型取代烷基、α‑或β‑构型丝氨酸残基、α‑或β‑构型苏氨酸残基。本发明专利技术将酶法合成所具有的高区域选择性和高效性结合到一起，并首次合成了P1抗原五糖，本发明专利技术所利用的糖基转移酶、糖核苷生成酶以及糖激酶均为原核生物来源，具有蛋白表达量高、底物适应性广泛、催化效率高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及糖类物质的合成方法，尤其涉及一种人血型抗原P1五糖的合成方法。
技术介绍
目前已经发现并被国际输血协会承认的血型系统有30种，常见的血型系统有ABO型血型系统和Rh型血型系统。1927年，Landsteiner和Levine发现了P血型系统(P Blood GroupSystem)，随后Morgan和Watkins等的研究揭示其抗原决定簇为三糖结构Galα(l-4)Galβ(l-4)GlcNAc(如图1所示)。1974年，Naiki和Marcus等科学家研究发现P，PK(如图2所示)和P1抗原以糖脂形式存在于人血红细胞以及其他细胞，并解析出P1抗原的完整结构为五糖Galα(l-4)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)Glc(如图3所示)。P1抗原除了与其他人血型糖抗原一样会导致血管内溶血性输血反应外，其还与习惯性流产有关。此外，最近的研究表明P1抗原过度表达与卵巢癌细胞表面并与肿瘤的转移相关。大量研究表明P、PK和P1抗原可以作为微生物和生物毒素的受体，进而与细菌和病毒等的感染密切相关。肠致病性大肠杆菌E.coli O157：H7是最常见的产志贺毒素大肠杆菌。志贺毒素通过与细胞表面的寡糖受体结合，从而黏附于细胞表面，引起腹泻、出血性结肠炎甚至是危及生命的溶血性尿毒综合征。目前针对产志贺毒素大肠杆菌感染没有有效的疗法，常规的抗生素治疗已经表明会增强志贺毒素的产生，增加病人患溶血性尿毒综合征的风险。因而以志贺毒素的受体糖链作为抗菌剂来中和毒素成为目前研究的热点，同时高活性的受体糖链也有望作为先导分子用以发展高灵敏性的诊断试剂用以志贺毒素产生菌感染的早期发现。在志贺毒素与不同寡糖受体的结合实验中发现P1抗原五糖[Galα(l-4)Galβ(l-4)GlcNAcβ(l-3)Galβ(l-4)Glc]是包括Pk、Pk三糖类似物，以及P1抗原三糖表位(Galα(l-4)Galβ(l-4)GlcNAc)等一系列分子中结合能力最强的受体。因此，P1抗原五糖可作为志贺毒素产生菌的理想毒素中和剂，阻止其与人体细胞表面受体的结合，发挥抗细菌感染的作用，同时其也有望用以发展更为灵敏的志贺毒素产生菌感染的早期诊断试剂。鉴于上述情况，大量合成P1抗原五糖，发展以其为先导化合物抗产志贺毒素大肠杆菌侵袭人体的新型药物及发展新型早期诊断试剂具有重大意义。目前，已有文献报道用化学法和酶法对P1抗原三糖的合成进行研究。但是，对拮抗作用更强的P1抗原五糖的合成至今并未见报道。由于生物体内环境十分复杂，就目前的研究水平而言，以提取的方式从生物体内获得大量结构单一的P1抗原五糖的难度非常大。对于化学合成而言，由于P1抗原五糖本身固有的活性相似的多羟基结构，在合成过程中需要繁琐的保护以及脱保护步骤来保证区域、立体选择性，导致其反应步骤多、总体收率低。以一锅多酶体系为经典方法合成复杂寡糖可以克服化学合成法的不足，但就目前酶的来源和实际应用的角度来说，合成寡糖链所应用的酶主要分为两类：一种是糖苷酶，其催化合成的效率较低，底物适应性较宽；第二种是糖基转移酶，该类酶具有很高的催化效率及严格的底物选择性。糖苷酶因其来源丰富、性能稳定、反应简单、底物适应性强等优点目前在工业上己被采用，但此类酶催化的寡糖合成收率欠佳。此外，由于糖苷酶催化的转糖基反应的区域选择性不高，而且合成反应中还存在水解反应的竞争，导致产物不均－，难于分离纯化，限制了其广泛应用。天然糖基转移酶的使用也存在着很多的限制因素：酶的来源有限；酶的不稳定性、复杂性导致分离纯化困难；酶催化的糖苷化反应需要价格昂贵的核苷活化糖作糖基给体；酶具有严格的底物特异性，对非天然或异常的底物耐受能力较差。以上缺点极大地限制了糖苷酶和糖基转移酶在一锅多酶体系中合成复杂寡糖中的应用。因此，寻求一种快速、高效合成P1抗原五糖的方法是目前亟待解决的问题。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种人血型抗原P1五糖的合成方法，采用“一锅多酶”体系模块化组装合成天然P1抗原五糖，为系统研究P1抗原五糖作为抗产志贺毒素大肠杆菌在药物方面的应用奠定基础。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种人血型抗原P1五糖的合成方法，包括：利用“一锅多酶”体系将半乳糖以β1-4糖苷键偶联到式(III)所示的三糖上，合成式(IV)所示的四糖的步骤；以及利用“一锅多酶”体系将半乳糖以α1-4糖苷键偶联到式(IV)所示的四糖上，合成式(I)所示的五糖的步骤；式(I)、式(III)和式(IV)中，R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代
烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基。上述合成方法中，利用“一锅多酶”体系合成式(IV)所示的四糖的步骤中，先后用到的酶分别为：半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)。上述合成方法中，利用“一锅多酶”体系合成式(I)所示的五糖的步骤中，先后用到的酶分别为：半乳糖激酶(GalK)、糖核苷生成酶(BLUSP)以及α1-4半乳糖转移酶(NmLgtC)。上述合成方法中，式(III)所示的三糖是利用“一锅多酶”体系将N-乙酰氨基葡萄糖以β1-3糖苷键偶联到式(II)所示的乳糖苷上制备得到；所述“一锅多酶”体系先后用到的酶分别为：N-乙酰氨基葡萄糖激酶(NahK)、糖核苷生成酶(GlmU)以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(HpLgtA)。式(II)中，R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基。在本专利技术的一个具体实施方案中，式(II)所示的β-构型的乳糖苷Galβ(l-4)GlcOR1的合成采用以下方法：将乳糖与醋酐进行反应后，将其全部裸露羟基用乙酰基保护；然后利用微波反应仪将全乙酰化的乳糖进行β-构型糖苷化反应，然后依次叠氮化和脱保护后即得；可作为下步酶反应受体的乳糖苷，反应的方程式如图7所示。在本专利技术的一个具体实施方案中，式(III)所示的三糖的合成方法为：将式(II)所示的乳糖苷、N-乙酰氨基葡萄糖(1.3-3.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.3-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.3-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH 5.0-10.0)配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5-8.5，然后添加N-乙酰氨基葡萄糖激酶(NahK)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成酶(GlmU)以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(HpLgtA)，反应时间为3-72小时，待反应完成后，纯化即可直接获得式(III)所示的三糖化合物；可作为下步酶反应受体，反应的方程式如图8所示。在本专利技术的一个具体实施方案中，式(IV)所示的四糖的合成方法为：将式(III)所示的三糖、半乳糖(1.3-3.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(1.3-5.0当量)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)(1.3-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mmol、pH 5.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人血型抗原P1五糖的合成方法，包括：利用“一锅多酶”体系将半乳糖以β1‑4糖苷键偶联到式(III)所示的三糖上，合成式(IV)所示的四糖的步骤；以及利用“一锅多酶”体系将半乳糖以α1‑4糖苷键偶联到式(IV)所示的四糖上，合成式(I)所示的五糖的步骤；式(I)、式(III)和式(IV)中，R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α‑或β‑构型取代烷基、α‑或β‑构型丝氨酸残基、α‑或β‑构型苏氨酸残基。

【技术特征摘要】
1.一种人血型抗原P1五糖的合成方法，包括：利用“一锅多酶”体系将半乳糖以β1-4糖苷键偶联到式(III)所示的三糖上，合成式(IV)所示的四糖的步骤；以及利用“一锅多酶”体系将半乳糖以α1-4糖苷键偶联到式(IV)所示的四糖上，合成式(I)所示的五糖的步骤；式(I)、式(III)和式(IV)中，R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基。2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，利用“一锅多酶”体系合成式(IV)所示的四糖的步骤中，先后用到的酶分别为：半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及β1-4半乳糖转移酶。3.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，利用“一锅多酶”体系合成式(I)所示的五糖的步骤中，先后用到的酶分别为：半乳糖激酶、糖核苷生成酶以及α1-4半乳糖转移酶。4.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于式(III)所示的三糖是利用“一锅多酶”体系将N-乙酰氨基葡萄糖以β1-3糖苷键偶联到式(II)所示的乳糖苷上制备得到；式(II)中，R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-构型苏氨酸残基；所述“一锅多酶”体系先后用到的酶分别为：N-乙酰氨基葡萄糖激酶、糖核苷生成酶以及β1-3N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。5.如权利要求4所述的合成方法，其特征在于，式(II)所示的乳糖苷的合成采用以下方法：将乳糖与醋酐进行反应后，将其全部裸露羟基用乙酰基保护；然后利用微波反应仪将全乙酰化的乳糖进行β-构型糖苷化反应，然后依次叠氮化和脱保护后即得。6.如权利要求4所述的合成方法，其特征在于，式(III)所示的三糖的合成方法为：将式(II)所示的乳糖苷、N-乙酰氨基葡萄糖(1.3-3.0当量)、腺嘌呤核苷三磷酸(1.3-5.0当量)、
\t尿嘧啶核苷三磷酸(1.3-5.0当量)、MgCl2(5-100mmol)、Tris-HCl缓冲液(10-500mm...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈聪聪，达佤才郎，曹鸿志，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37