鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用技术

本发明专利技术公开了鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用，对已知的鼠李糖基转移酶基因rhlA、rhlB、rhlC根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行优化和人工合成，分别命名为SyrhlA、SyrhlB、SyrhlC；合成大肠杆菌核糖体结合位点(RBS)连接至SyrhlB上游，并在RBS上游连接SyrhlA，构建为基因簇SyrhlA‑RBS‑SyrhlB；将SyrhlA‑RBS‑SyrhlB和SyrhlC构建在含有双启动子的质粒pACYCDuet‑1中，并导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达，实现了大肠杆菌利用葡萄糖为碳源合成鼠李糖脂，大大提高大肠杆菌合成鼠李糖脂的产量。

【技术实现步骤摘要】
鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用
本专利技术属于生物
，涉及鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用。
技术介绍
鼠李糖脂是生物表面活性剂的重要品种，能显著降低表面张力，具有优良的去垢、乳化和絮凝能力，并且具有无毒和生物降解的特性，在化工、医药、农业和环境修复等领域具有广阔的应用前景。鼠李糖脂最早于1949年由Jarvis和Johnson在铜绿假单胞菌中发现获得。铜绿假单胞菌能合成多种结构的鼠李糖脂，主要有双糖双脂结构、单糖双脂结构、双糖单脂结构和单糖单脂结构四种结构类型。其中脂肪链的长度及饱和程度不同，且各亚种菌株合成不同结构鼠李糖脂的比例不同，造成不同菌株合成的表面活性产物的性能各异。虽然铜绿假单胞菌是合成鼠李糖脂最主要的菌种，但由于其具有条件致病性，它合成鼠李糖脂的行为也与其致病性相关，因此限制了该菌种在鼠李糖脂生产上的应用。铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂的代谢途径受到群体感应系统(QS)的调控，其产物生成与细胞生长状态间存在复杂的耦合关系。如RhlI/R系统直接调控鼠李糖脂合成途径的转录表达，而LasI/R系统通过调控RhlI/R系统的转录来间接控制鼠李糖脂合成；再加上QS信号分子的淬灭系统对两套QS系统的负调控，构成对鼠李糖脂合成途径的转录调控网络。在这些调控元件综合作用下，细胞合成鼠李糖脂的产量和产率受到细胞密度等多种因素的复合控制。此外，假单胞菌合成的表面活物质主要为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂，分别由rhlAB和rhlC编码的鼠李糖基转移酶I和II催化合成，而rhlAB与rhlC位于基因组中不同位置，并受不同启动子调控转录。合成鼠李糖脂前体的代谢途径，如鼠李糖合成、脂肪酸合成途径中涉及的rmlBDAC、rhlYZ等基因也受不同QS系统调控转录。因此，不同生长状态下，鼠李糖脂合成的完整途径中，各反应步骤受调控表达的水平不同，造成产物单、双鼠李糖脂及代谢中间产物的比例不同，产物的表面活性、乳化性等亦有区别，影响发酵产品性能的稳定性。在发酵过程方面，铜绿假单胞菌以油脂为原料合成鼠李糖脂，造成鼠李糖脂产物成分复杂，增加了产物分离纯化的成本。采用大肠杆菌工程菌利用葡萄糖合成单鼠李糖脂，较为安全，遗传背景清晰，产物具有表面活性，产物的生物合成过程不受细胞群体感应的影响，可进行外源诱导物的人工调控合成，增强了生产过程的可控性，具有很好的应用前景。然而，现阶段所使用的大肠杆菌工程菌都是通过克隆铜绿假单胞菌基因组中rhlAB、rhlC等基因，导入大肠杆菌宿主细胞中。如Wang等构建的E.coliTnERAB，单鼠李糖脂产量为175mg/L(QinhongWang,XiangdongFang,BaojunBai,etal.BiotechnologyandBioengineering,2007,98(4):842-853)。Han等人扩增铜绿假单胞中rhlAB和rhlC基因，形成rhlAB-rhlC串联形式置于载体pET-30a(+)的T7启动子下游，鼠李糖脂产物中含有单鼠李糖脂和双鼠李糖脂，产量为120mg/L(LHan,PLiu,YPeng,etal.JournalofAppliedMicrobiology,2014,117(1):139-150)。Cabrera-Valladares等将铜绿假单胞菌中rhlAB基因和鼠李糖合成基因簇rmlBDAC同时在大肠杆菌中表达，单鼠李糖脂产量为120mg/L(NatividadCabrera-Valladares,Anne-PascaleRichardson,ClaritaOlvera,etal.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2006,73(1):187-194)。这些工作均未对鼠李糖脂合成基因进行针对大肠杆菌宿主的密码子优化和基因簇结构的优化，鼠李糖脂产量较低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供鼠李糖脂生产质粒。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述鼠李糖脂生产质粒的构建方法。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述大肠杆菌工程菌的应用。本专利技术的技术方案如下：一种鼠李糖脂生产质粒，质粒DJ202，核苷酸序列为序列表<400>1所示序列。上述鼠李糖脂生产质粒(质粒DJ202)的构建方法，具体步骤如下：(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列为序列表<400>3所示序列；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列为序列表<400>4所示序列；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列为序列表<400>5所示序列，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202。由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌，是由上述质粒DJ202导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL202。一种鼠李糖脂生产质粒，质粒DJ208，核苷酸序列为序列表<400>2所示序列。上述鼠李糖脂生产质粒(质粒DJ208)的构建方法，具体步骤如下：(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列为序列表<400>3所示序列；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列为序列表<400>4所示序列；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列为序列表<400>5所示序列，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列为序列表<400>6所示序列；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208。由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌，是由上述质粒DJ208导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208。由上述鼠李糖脂生产质粒获得的大肠杆菌工程菌，BL208/402，是由下述方法构建得到的：(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列为序列表<400>3所示序列；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鼠李糖脂生产质粒，其特征在于：为质粒DJ202，核苷酸序列为序列表<400>1所示序列。

【技术特征摘要】
1.一种鼠李糖脂生产质粒，其特征在于：为质粒DJ202，核苷酸序列为序列表<400>1所示序列。2.权利要求1所述鼠李糖脂生产质粒DJ202的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列为序列表<400>3所示序列；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列为序列表<400>4所示序列；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列为序列表<400>5所示序列，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202。3.由权利要求1所述鼠李糖脂生产质粒DJ202获得的大肠杆菌工程菌，其特征在于：是由上述质粒DJ202导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL202。4.一种鼠李糖脂生产质粒，其特征在于：为质粒DJ208，核苷酸序列为序列表<400>2所示序列。5.权利要求4所述鼠李糖脂生产质粒DJ208的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列为序列表<400>3所示序列；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列为序列表<400>4所示序列；在SyrhlB上游设计大肠杆菌核糖体结合位点RBS，其基因序列为序列表<400>5所示序列，构成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；(3)将片段RBS-SyrhlB通过酶切连接方式插入质粒DJ201中SyrhlA下游，构成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，获得质粒DJ202；(4)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlC，其基因序列为序列表<400>6所示序列；将SyrhlC通过酶切连接方式插入双启动子质粒pACYCDuet-1第二个T7启动子下游，获得质粒DJ205；(5)将片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通过PCR和酶切连接方式插入质粒DJ205中第一个T7启动子下游，获得质粒DJ208。6.由权利要求4所述鼠李糖脂生产质粒DJ208获得的大肠杆菌工程菌，其特征在于：是由上述质粒DJ208导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得用于合成鼠李糖脂的大肠杆菌基因工程菌株BL208。7.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于：为BL208/402，是由下述方法构建得到的：(1)人工合成经密码子优化的鼠李糖基转移酶基因SyrhlA，其基因序列为序列表<400>3所示序列；将SyrhlA通过酶切连接方式插入大肠杆菌表达质粒pET21a(+)的T7启动子下游，得到质粒DJ201；(2)密码子优化鼠李糖基转移酶基因SyrhlB，其基因序列为序列表<400>4所示序列；在SyrhlB上游设计大...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜瑾，张爱君，姜天翔，郝建安，王静，
申请(专利权)人：国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12