本发明专利技术公开了一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其构建方法和应用。获得丝胶蛋白1基因启动子、His 6序列、DDDDK序列、丝素轻链蛋白信号肽、丝素轻链蛋白基因3’末端序列、家蚕肌动蛋白基因A3启动子、EGFP基因和SV40序列，然后再构建质粒，第一表达框包括A3启动子、EGFP基因和SV40序列，第二表达框包括丝胶蛋白1基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、His 6序列、DDDDK和丝素轻链蛋白基因3’末端序列，且含有ApaI和NheI两个酶切位点。本发明专利技术质粒减少了构建donor质粒的工作量，提高了家蚕中部生物反应器工作效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及了一种质粒及其构建方法与应用，尤其是涉及了一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其构建方法和应用。
技术介绍
piggyBac转座子最初是从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368细胞株的基因组中分离得到的，是目前发现的转座活性最高的DNA转座子。piggyBac转座系统是一种非病毒载体，转座效率较高。与sleeping beauty相比，piggyBac载体容量较大，可携带18kb,可以实现多基因的共表达，且转座片段被切除后不会在原位点留下印迹(footprint)，基因组可以实现切除后精确修复，在可逆转基因的应用中具有重要作用。piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器的研究开展了十几年，世界各国的科学家致力于外源基因的表达，已经建成了以丝素蛋白轻链启动子(Fib-L Promoter)、丝素蛋白重链启动子(Fib-H Promoter)和丝胶蛋白1启动子(Ser1Promoter)表达外源蛋白的转基因家蚕丝腺生物反应器。由于piggyBac载体多数含有两个表达框，具有较多的元件和相同的酶切位点，所以，每次表达不同的外源基因时，需要从头构建质粒，组装启动子、信号肽、外源基因、polyA等结构，费时费力，工作效率低下。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提出了一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其构建方法和应用，具体是利用常规构建质粒的生物技术方法构建一种不含目的基因，但拥有其它所有必需元件的通用型质粒。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案的步骤如下：一、一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒：所述的质粒为pBac[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FL PA]，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框。一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3 Promoter–EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝胶蛋白1基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链
基因3’末端的表达框，即Ser1Promoter-Fibroin L chain signal peptide-His 6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA。所述的DDDDK-FLPA之间含有专一性的ApaI和NheI的两个酶切位点，两个酶切位点用于将质粒特异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。二、一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒的构建方法，方法的步骤如下：1)通过分子生物学方法构建包含[丝胶蛋白1基因启动子575-海肾萤光素酶基因-SV40]-[丝胶蛋白1基因启动子4023-萤火虫萤光素酶基因-SV40]-[A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40]([Ser 575-Rluc-SV40]-[Ser 4023-Fluc-SV40]-[A3-GFP-SV40])的质粒piggy-14413，以质粒piggy-14413为模板，质粒piggy-14413的碱基序列如SEQ ID NO.1，以如SEQ ID NO.2的ggtaccGTTGGCGGTCTTTGGATCG序列1和如SEQ ID NO.3的gaattccttaagGCACACACACTACATACCATGTATTTG序列2为引物，采用PCR扩增获得片段长为583bp的丝胶蛋白1基因启动子，其碱基序列如SEQ ID NO.4；2)用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列(FL692-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的质粒piggy-4086，质粒piggy-4086其碱基序列如SEQ ID NO.5，得到长度为3378bp的包含丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列(FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)的片段；3)连接步骤1)获得的丝胶蛋白1基因启动子与步骤2)获得的包含丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列的片段，得到包含丝胶蛋白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列(Ser1 promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的质粒piggy-3969；4)用AflII和BglII双酶切步骤3)获得的质粒piggy-3969，获得长度为1322bp的包含丝胶蛋白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列(Ser-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)的片段；5)用AflII和BglII双酶切包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)和Amp抗性基因的质粒piggy-6212，质粒piggy-6212的碱基序列如SEQ ID NO.6，得到长度为5870bp的包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)的片段；6)连接步骤4)获得的包含丝胶蛋白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-
六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列的片段与步骤5)获得的包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40的片段，得到包含[A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40]-[丝胶蛋白1基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列([A3-EGFP-SV40]-[Ser1 promoter--FLSP-His-DDDDK-FLPA])的质粒piggy-7192作为本专利技术所述的质粒，即为家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其碱基序列如SEQ ID NO.7。三、所述质粒用于构建表达各种外源基因的donor质粒的应用。本专利技术先设计引物，用PCR的方法获得获得丝胶蛋白1基因启动子的序列；再分别用限制性内切酶酶切相应的片段，电泳得到目的条带后，切胶回收，用T4连接酶将相应的片段相连，使所需的元件(Ser1Promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA)依次连接；接着将piggy-6212质粒中的标记基因与上述元件整合到同一个质粒，得到通用型质粒，最终如图1所示。本专利技术的有益效果是：本专利技术的质粒可对于任意一种外源基因，只需经一步酶切连接反应，就将任何一种外源基因导入质粒，完成表达外源基因质粒的构建。附图说明图1是本专利技术Ser1通用型质粒的组成示意图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术的实施例如下：(1)设计引物，以piggy-14413质粒(SEQ ID NO.1)为模板,获得丝胶基因启动子(SEQ ID NO.4)。并在启动子5’端加EcoRⅠ的酶切位点，在3’端加KpnI的酶切位点。用EcoRⅠ和KpnI双酶切PCR产物，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其特征在于：所述的质粒为pBac[A3‑EGFP‑SV40]‑[Ser1promoter‑FLSP‑His 6‑DDDDK‑FLPA]，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框。
【技术特征摘要】
1.一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其特征在于：所述的质粒为pBac[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA]，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框。2.根据权利要求1所述的一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其特征在于：一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3Promoter–EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝胶蛋白1基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Ser1 Promoter-Fibroin L chain signal peptide-His 6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA。3.根据权利要求1所述的一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其特征在于：所述的DDDDK-FLPA之间含有专一性的ApaI和NheI的两个酶切位点，两个酶切位点用于将质粒特异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。4.一种家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒的构建方法，其特征在于方法的步骤如下：1)通过分子生物学方法构建包含[丝胶蛋白1基因启动子575-海肾萤光素酶基因-SV40]-[丝胶蛋白1基因启动子4023-萤火虫萤光素酶基因-SV40]-[A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40]的质粒piggy-14413，以质粒piggy-14413为模板，以如SEQ ID NO.2的ggtaccGTTGGCGGTCTTTGGATCG序列1和如SEQ ID NO.3的gaattccttaagGCACACACACTACATACCATGTATTTG序列2为引物，获得片段长为583bp的丝胶蛋白1基因启动子，其碱基序列如SEQ ID NO.4；2)用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟伯雄，张玉玉，叶露鹏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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