本发明专利技术公开了一种鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备方法及其制品。本发明专利技术将鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因和VP2基因进行优化。本发明专利技术进一步将优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或VP2基因在家蚕生物反应器中进行表达。本发明专利技术还公开了一种鸡传染性法氏囊病核酸疫苗的制备方法，包括：将优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或VP2基因克隆到哺乳动物启动子控制的杆状病毒转移载体中，与杆状病毒重组感染昆虫宿主，在昆虫宿主中呈递外源基因，制备得到核酸疫苗。用所表达的抗原制备疫苗免疫动物或将核酸疫苗经过注射或者口服免疫动物，均能为动物提供有效的免疫保护。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鸡传染性法氏囊病病毒抗原，尤其涉及利用家蚕杆状病毒表达系统在 昆虫体内表达传染性法氏囊病病毒抗原的方法及其制品，本专利技术还涉及利用杆状病毒表达 系统在家蚕生物反应器中制备鸡传染性法氏囊病核酸疫苗的方法，属于鸡传染性法氏囊病 病毒抗原及核酸疫苗的制备领域。
技术介绍
鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒 (Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种急性接触传染性疾病。目前，预防IBD的主要疫苗为弱毒苗和灭活苗。但是，随着IBDV变异株和超强毒 株的出现，经常导致免疫失败，因此开发新的疫苗成为必然。在过去的几十年，许多研宄人 员已经利用大肠杆菌、禽痘病毒、重组火鸡疱瘆病毒（HVT)、毕赤酵母、植物等多种表达系统 研制基因工程疫苗。但是当前应用这些表达系统存在一些缺陷，其中大肠杆菌表达的VP2 蛋白多以包涵体形式存在，不可溶，必须经过变性复性，但IBDV核衣壳蛋白的抗原表位具 有构像依赖性，变性的结构蛋白对鸡没有保护性，变性再复性的VP2也失去了诱导鸡产生 中和抗体的能力。重组活载体疫苗不但存在实验室和生产过程中的安全问题，与普通活疫 苗一样发生基因突变、重组的几率也相对较高。利用转基因植物生产IBDV疫苗，其表达量 不高，实验操作过程繁琐。因此，选择一种合适的表达系统研制高效、安全、经济的新型IBD 疫苗成为研宄人员共同努力的方向。 杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群，发现最早、研宄最多、实用性最强的昆虫 病毒。昆虫杆状病毒表达载体系统（Baculovirus expression vector system, BEVS)自 1983年问世以来（Smith et al.，1983)，由于其具有高效表达、安全、易操作等特点，已经成 为研宄和生产各种原核、真核蛋白的有力工具。 因此，利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、高效的表达传染性法氏囊病 病毒抗原以及制备传染性法氏囊病核酸疫苗，将为鸡传染性法氏囊病新的基因工程疫苗的 生产奠定良好的基础。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内 高效的表达鸡传染性法氏囊病病毒抗原以及制备鸡传染性法氏囊病核酸疫苗的方法。 为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是： 本专利技术首先公开了优化后的鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus)VP2/4/3 多聚蛋白基因，其核苷酸序列为 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID NO. 6 或 SEQ ID NO. 7 所示； 优化后的鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus)VP2基因， 其核苷酸序列为SEQ ID NO. 4所示。 本专利技术分析了近些年流行的 24 条 IBDV(Infectious bursal disease virus)毒 株的多聚蛋白序列，利用OptimumGene?技术对VP2/4/3蛋白基因序列进行优化，根据生物 反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白 折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、 RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白 序列不变，共获得4条优化后的序列，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 或 SEQ ID NO. 7 所示。 本专利技术优化获得的SEQ ID NO. 3所示序列，使密码子适应指数（Condon Adaption Index，CAI)由原来的0.84变成0.87 ;基因序列的GC含量降低，由原来的53. 72 %变成 50. 51%，使多聚蛋白基因在家蚕中的转录效率与翻译效率有了较大的提高。为了提高在家 蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了 Kozak序列AAC，将终止密码 子改为TAA，提高了翻译终止效率。此外，去除了基因序列内部的BamH I、EcoR I、Sma I 等限制性酶切位点，在基因上游加上了 EcoR I和BamH I，在基因下游加上了 Pst I限制 性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体中。 本专利技术将优化后的VP2/4/3-0基因序列（SEQ ID NO. 3所示）在家蚕生物反应 器中进行可溶性表达，ELISA检测表明，优化后的VP2/4/3-0基因在家蚕中表达量高比 IBDV-VP2/4/3基因原始序列在家蚕中表达量高出2-3倍，在6400倍稀释甚至更高稀释度 下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。对优化后的SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7所示序列进行相同的基因操作，均获得了在蚕体内或蛹内扩增，但表达效率均低于SEQ ID NO. 3所示序列。 本专利技术以优化的VP2/4/3-0基因序列为模板，扩增VP2-0基因（SEQ ID NO. 4所 示）并在家蚕生物反应器中进行表达，ELISA检测结果表明，在3200倍稀释甚至更高稀释 度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应，表明VP2-0基因在家蚕中的表达量比原始序列 在家蚕中的表达量要高。 本专利技术还公开了含有所述优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基 因或所述优化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达载体以及含有所述表达载体的 宿主或宿主细胞。 本专利技术进一步公开了一种鸡传染性法氏囊病病毒抗原的制备方法，包括以下步 骤： (1)分别将鸡传染性法氏囊病病毒原始VP2/4/3多聚蛋白基因、原始VP2基因、优 化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或优化后的鸡传染性法氏囊病病毒 VP2基因克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体； (2)将重组转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒； (3)将重组杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫宿主，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿 主表达相应的抗原，纯化，即得。 本专利技术还公开了一种鸡传染性法氏囊病核酸疫苗的制备方法，包括以下步骤： (1)分别将鸡传染性法氏囊病病毒原始VP2/4/3多聚蛋白基因、原始VP2基因、优 化后的鸡传染性法氏囊病病毒VP2/4/3多聚蛋白基因或优化后的鸡传染性法氏囊病病毒 VP2基因克隆到哺乳动物启动子控制的杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体； (2)将重组转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒； (3)将重组杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫宿主，在昆虫宿主或细胞中呈递外源基 因，制备得到核酸疫苗。 本专利技术所述哺乳动物启动子选自CAG启动子、PEC启动子、CMV启动子、人巨细胞病 毒早期启动子、人延伸因子1-亚基启动子、Rous肉瘤长末端重复序列、人leukosialin基 因启动子、鼠3-磷酸甘油激酶1基因启动子、人泛素蛋白C基因启动子、鸡|3 -肌动蛋白启 动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子或鼠乳房瘤病毒启动子；优选为CAG启动子。 本专利技术所述鸡传染性本文档来自技高网...
【技术保护点】
优化后的鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus)VP2/4/3多聚蛋白基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡小元，李轶女，张志芳，李田田，杨鑫，易咏竹，吕言娜，王智权，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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