人α-乳清白蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种人α-乳清白蛋白单克隆抗体。由保藏号为CGMCC No.7459的小鼠杂交瘤细胞产生。本发明专利技术还提供所述人α-乳清白蛋白单克隆抗体的制备方法及应用。所述单克隆抗体可用于检测转基因牛奶与奶粉中的人α-乳清白蛋白。本发明专利技术的人α-乳清白蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，直接对外源表达蛋白进行检测，避免了基因提取费时费力且容易污染的问题；本发明专利技术检测成本低廉，结果迅速，灵敏可靠，可以稳定、方便地提供准化的试剂，便于实现工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
人α-乳清白蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用
本专利技术涉及单克隆抗体的制备与应用，尤其涉及一种人α-乳清白蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
α-乳清白蛋白（α-LA）是分子量小、酸性的、高亲和性的Ca2+结合蛋白。它几乎存在于所有的哺乳动物乳汁中。人α-乳清白蛋白的分子量为14.1KD。α-乳清白蛋白是人乳中的重要组成成分，约占总蛋白含量的25-35%，而在牛奶中只占总蛋白含量的2-5%。α-乳清白蛋白可与Ca2+、Zn2+等多种二价阳离子结合，能促进微量元素的吸收。在乳腺分泌细胞中，α-乳清白蛋白作为调节亚基通过与半乳糖苷转移酶相互作用催化乳糖的合成。最近还发现人α-乳清白蛋白的不同折叠突变体具有杀菌和诱导肿瘤细胞死亡的功能，还能与油酸形成复合物杀死皮肤的乳突淋瘤，具有广阔的应用前景。由于α-乳清白蛋白具有如此重要的功能，人α-乳清白蛋白可以被开发成婴幼儿食品，保健品，运动饮料以及抗菌、抗肿瘤药物等。据FAO预测，全球每年婴幼儿食品市场为58亿美元，人α-乳清白蛋白已成为这些产品的重要成分，加上其它产品开发，人α-乳清白蛋白的市场前景非常巨大。但是目前市场上供应的α-乳清白蛋白主要是从牛奶中纯化的牛α-乳清白蛋白，不过由于牛α-乳清白蛋白在牛乳中含量低（1.2g/L），纯化工艺复杂，而且成本偏高，生产的α-乳清白蛋白无法满足市场需求。更重要的是，牛α-乳清白蛋白并不具备人α-乳清白蛋白的一些营养价值和重要功能，因此人α-乳清白蛋白具有广阔的开发应用前景。但是由于来源有限，限制了人α-乳清白蛋白作为药用蛋白和保健品的使用，因此人们开始利用转基因动物即动物乳腺生物反应高效表达重组人α-乳清白蛋白。同时，与转基因相伴而生的生物安全问题引起了公众和管理部门的强烈关注和重视。建立精准、快速的检测技术并科学、系统地进行生物安全评价，可防止转基因动物或产品在研究、生产、销售时发生扩散、污染等安全隐患进行检测和监测技术储备和支撑。这不仅是维护消费者知情权和在国际贸易中维护国家利益的必要手段，也是我国履行国际义务、维护国家形象的重要保障。乳铁蛋白的检测方法有很多，其中ELISA检测法以其快速、准确、灵敏且一次能处理多个样而倍受关注。目前国内外用于ELISA检测的抗体为多克隆抗体，而以单克隆抗体为基础建立起的免疫学检测试剂盒很少。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种人α-乳清白蛋白单克隆抗体。为了实现本专利技术的目的，本专利技术首先提供一株能分泌产生所述人α-乳清白蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞ZZYhLY7E1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏日期为2013年4月26日，保藏编号为CGMCCNo.7459。本专利技术还提供了人α-乳清白蛋白单克隆抗体，其由所述杂交瘤细胞株分泌获得。本专利技术还提供了人α-乳清白蛋白单克隆抗体的制备方法，用重组蛋白α-LF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗α-LA的5株细胞1C7、5E8、5G9、6E6、7E1。取杂交瘤细胞（效价较高同时细胞状态好）注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得人α-乳清白蛋白单克隆抗体。经鉴定腹水制备前细胞上清效价检测显示细胞7E1效价最高。7E1细胞亚型为IgG1。7E1细胞能与免疫原α-LA反应，不与筛选原牛乳铁蛋白（bLA）反应。用细胞7E1制备腹水，检测腹水效价为1:81000，腹水纯化检测单克隆抗体效价为1:81000，抗体纯度高于95%。本专利技术还提供前述人α-乳清白蛋白单克隆抗体在检测转基因牛奶与奶粉中人α-乳清白蛋白中的应用。所述人α-乳清白蛋白单克隆抗体可用于检测转基因牛奶中表达量数量级为g/L的人α-乳清白蛋白。WesternBlot检测显示抗体7E1只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应。本专利技术还提供前述人α-乳清白蛋白单克隆抗体在制备用于检测转基因牛奶与奶粉中人α-乳清白蛋白试剂盒中的应用。所述人α-乳清白蛋白的夹心ELISA检测试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：1）洗涤液；2）底物显色液；3）反应终止液；4）人α-乳清白蛋白标准品。所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/LH2SO4。本专利技术的有益效果：本专利技术的人α-乳清白蛋白单克隆抗体纯度高，效价高，灵敏度高，无交叉反应，专一性强，可特异性识别转基因样品，可直接对外源表达蛋白进行检测，同时避免了核酸检测方法中，基因提取费时费力且容易污染的问题。检测成本低廉，结果迅速，灵敏可靠，而且可以稳定、方便地提供准化的试剂，便于实现工业化生产。附图说明图1为免疫抗原（6his-MBP-CCG343）及检测抗原(PGEX-6P-1-CCG343)的表达纯化；其中，1a：6his-MBP-CCG343样品；1b：6his-MBP-CCG343穿柱液；1c：6his-MBP-CCG343洗脱1；1d：6his-MBP-CCG343洗脱2；2a：PGEX-6P-1-CCG343样品；2b：PGEX-6P-1-CCG343穿柱；2c：PGEX-6P-1-CCG343洗脱1；2d：PGEX-6P-1-CCG343洗脱2；图2为实施例2Western-blot检测结果图；其中，1为PGEX-6P-1-CCG343；2为6his-MBP-CCG343；图3为杂交瘤细胞上清与样品Wester-blot试验结果；其中，3：转人乳铁蛋白基因奶牛牛奶样品；5：牛乳清白蛋白；4：转人α-乳清白蛋白基因奶粉样品；图4为转基因牛奶及奶粉样品WesternBlot检测；其中，1：转人α-乳清白蛋白基因牛奶样品；2：转人α-乳清白蛋白基因奶粉样品；3：三元极致牛奶样品；4：人α-乳清白蛋白；5：牛α-乳清白蛋白；6：三元极致牛奶样品；图5为转基因牛奶样品的检测标准曲线。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。转人α-乳清白蛋白基因奶牛样品来自中国农业大学农业生物技术国家重点实验室；单克隆抗体和多克隆抗体由中国检验检疫科学研究院动检实验室构建；日本大耳白兔购自军事医学科学研究院实验动物中心；人α-乳清白蛋白购自Sigma公司。酶标板购自宏捷成生物公司；HRP标记试剂盒（CatNo31488）购自Pierce公司；山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP购自中杉金桥生物公司；TMB（可溶型）购自天根生物公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、96孔酶标板购自北京宏捷成生物科技有限公司；IgG纯化试剂盒购自嘉兴行建生物科技有限公司，石蜡油购自BBI公司。层析柱购自Phamacia公司；涡旋仪购自江苏海门市其林贝尔公司；高速微量离心机购自美国Sigma公司；ElixRMilliQRBiocelTM纯水系统购自美国Millipore公司；舒适性恒温仪购自eppendorf公司；台式冷冻离心机、真空浓缩仪购自eppendorf公司；电热恒温水浴锅购自PolyScience公司；NanoDrop1000本文档来自技高网...

【技术保护点】
杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2013年4月26日，保藏编号为CGMCC NO.7459。

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2013年4月26日，保藏编号为CGMCCNO.7459。2.人α-乳清白蛋白单克隆抗体，其特征在于，其由权利要求1所述杂交瘤细...

【专利技术属性】
技术研发人员：林祥梅，朱振营，王勤，刘建，付伟，李晓琳，孙敏，薛振华，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11