克隆人自体基因的胚胎干细胞定向诱导成体细胞分化制造技术

克隆人自体基因的胚胎干细胞定向诱导成体细胞分化技术涉及采用体细胞核移植技术克隆人自体基因的胚胎，建立胚胎干细胞系和体外定向诱导人成体细胞分化技术。解决人类细胞、组织和器官移植所面临的供体严重缺乏和排斥反应两大难题。采用核移植克隆技术将人体细胞的细胞核转移到健康人或动物的去核卵母细胞中，经融合激活后，培养发育至囊胚。取囊胚内细胞团，可得到与供者同基因的胚胎干细胞。建立胚胎干细胞系，大量扩增的胚胎干细胞在一定条件下可定向诱导分化为人体所需要的，具有相同组织特异性的神经细胞、造血干细胞、成骨细胞、胰岛细胞和心肌细胞等成体细胞，临床移植不会产生移植排斥反应。另外，胚胎干细胞系可用于基因治疗等多种类型研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及采用核移植技术克隆人自体基因的胚胎，建立胚胎干细胞系和体外定向诱导人成体细胞分化技术。
技术介绍
美国《科学》杂志上列出了2002年值得关注的六大热门科技领域，干细胞研究位于首位。未来抢占生命科学制高点的将会是干细胞及组织工程技术。当前种子细胞来源不足是限制细胞、组织工程发展的瓶颈问题，而免疫排除反应则是限制细胞、组织和器官移植成功的一个重要原因。随着“治疗性克隆”技术的逐步成熟，采用体细胞克隆技术，可以从人体细胞中克隆出早期胚胎，然后从中提取胚胎干细胞。这种细胞具备分化成人体各种细胞的能力，利用它有可能在体外培育出与病人遗传特征完全相同的细胞、组织或器官，将同时解决人类细胞、组织和器官移植所面临的供体严重缺乏和排斥反应两大难题。1997年英国科学家应用核移植克隆胚胎技术，培育出了世界上第一只用体细胞克隆绵羊(多利)，从此掀起了动物克隆的浪潮。1998年美国科学家不仅成功克隆鼠，而且将成年牛、羊、猪、猴和大鼠等的成纤维细胞核移植到去核的牛卵母细胞中，有效地使体细胞重新编程，获得重构胚。这些技术的成功极大促进了异种间核移植克隆技术的发展。采用核移植克隆技术生产囊胚，从囊胚内细胞团(inner cell mass，ICM)中获取胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)已成为国内外学者所关注的热门技术。因为克隆的胚胎干细胞与自然受精而产生的胚胎干细胞具有相似的无限扩增能力和在体内外分化的多能性，可分化成为人体200多种细胞类型，从而形成机体的任何组织和器官。随着此项技术的不断进步，在体外将产生全新的自体基因的细胞、组织和器官，用来取代病变的细胞、组织、器官，治疗目前不能治疗的许多疾病。ES细胞是哺乳动物胚胎发育早期的一类未分化的二倍体细胞，研究表明它具有以下特性(1)ES细胞在不分化前提下，通过体外培养可大量扩增。(2)ES细胞是一种具有很高分化潜能的细胞，可以分化形成各种类型的细胞。应该说ES细胞是具有全能分化特性的细胞。ES细胞的定向分化是目前组织工程领域研究的重点。(3)ES细胞具有种系传递能力。因此胚胎干细胞就成为研究哺乳动物早期胚胎发生、基因表达调控、组织形成及遗传病和癌症发生和治疗等工作的理想模型。第一个未分化的小鼠ES细胞系是1981年由英国的Evans和Kaufman成功从延迟着床的囊胚内细胞团中分离获得。1995年美国的Thomson等从恒河猴的囊胚中分离建立了世界上第一株灵长类动物ES细胞，以后经过不懈地努力探索，直到1998年Thomson等从体外受精卵囊胚中分离到了人类的ES细胞，在科学界引起了轰动，从此人类ES细胞研究掀起了高潮，研究的焦点转向了调控其分化、细胞治疗和组织工程种子细胞等研究。建立ES细胞系时对体外培养条件要求十分严格，当培养条件有变化时，ES细胞就会分化。如果将胚胎干细胞进行悬浮培养就会形成“类胚体”(embryonic body，EB)，它是进一步定向诱导分化的前提，对类胚体进一步诱导可产生各种不同的细胞。近年来，小鼠或人的ES细胞已经被成功诱导分化为三胚层来源的多种组织细胞，如造血细胞、心肌细胞、肌肉细胞、软骨细胞、骨细胞、神经细胞、胰岛素分泌细胞、血管和内皮细胞等。1999年Hole等先后诱导小鼠ES细胞体外分化出红系、粒-单系、巨核系、淋巴细胞系等；2000年Reubinoff等成功诱导ES细胞发育成造血干细胞。1994年Rohwedel等诱导出肌肉细胞。Fraichard等发现EB中表达神经细胞和神经胶质细胞的共同前体细胞的特有标志-巢蛋白。ES细胞体外可以定向分化为几乎所有类型的组织细胞，并且具有正常的核型，未分化状态下能够长时间的保持增殖能力，为体外大量扩增提供了可能。由于ES细胞具有无限增殖和多向分化的双重能力，人ES细胞可望为人类器官重建提供无限的种子细胞来源。细胞、组织、器官移植性治疗是个性治疗的原则，异种、同种异体干细胞用于临床会引起免疫排斥反应。其主要原因是组织相容性复合体(MHC)不同。因此干细胞的来源与数量是细胞治疗最关键的问题，干细胞组织工程技术的发展和完善，将使人们能用上自己基因的干细胞或干细胞衍生的新组织器官，来替代病变或衰老的组织和器官，治疗目前不能治疗的多种疾病。所以，目前开发一种能提供相同组织特异性的人胚胎干细胞的技术势在必行。为此克隆人自体基因的ES细胞诱导定向目的干细胞分化移植治疗，或克隆人组织、器官工程是解决细胞、组织移植治疗的根本，是21世纪国际研究焦点。经文献查阅和专利检索，目前虽然J.罗贝尔等(CN 1299408A，2001年6月13日公开)通过异种间核移植得到干细胞样细胞集落，但未对细胞集落性质进行鉴定，所以算不上干细胞系。黄禹锡(CN 1304444A，2001年7月18日公开)通过种间核转移技术生产人类克隆胚胎可以得到人类胚胎干细胞，但未得到胚胎干细胞系。黄绍良等(CN 1387565A，2003年6月18日公开)建立的胚胎干细胞系是利用受精卵囊胚内细胞团传代培养而获得。在本专利技术之前未见通过核移植克隆技术成功建立人自体基因的胚胎干细胞系的报道，更无将核移植克隆的人自体基因胚胎干细胞定向诱导分化为造血干细胞、神经细胞、成骨细胞、胰岛细胞、心肌细胞等人体细胞的报道。专利技术目的和意义胚胎干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能，它所产生的子代细胞与其具有相同的基因型和表现型。作为“种子细胞”的干细胞可以通过细胞、组织工程技术在体外发育成人体各种组织器官中的细胞，供临床移植所需，并可作为基因疗法的靶细胞用于治疗和研究。要真正使胚胎干细胞的研究和应用进入临床领域，就必须建立人类胚胎干细胞系，获得能在体外大量增殖的人胚胎干细胞，我们才有足够的“种子”和“材料”为细胞治疗、器官移植、基因治疗和进行各类相关研究提供源源不断的供体。采用核移植克隆技术创造与病人组织遗传构成完全相同的细胞，建立人胚胎干细胞系，在体外可定向诱导分化为人体所需要的全新的、无免疫异原性的细胞、组织和器官，用来取代病变的细胞、组织和器官，可避免移植排斥反应的发生，具有良好的临床应用前景。此技术平台的建立为人类治疗性克隆技术的发展做出突出贡献。专利技术概述采用体细胞核移植技术克隆人自体基因的胚胎，建立胚胎干细胞系和体外定向诱导人成体细胞分化，可同时解决人类细胞、组织和器官移植所面临的供体严重缺乏和排斥反应两大难题。我们从需要救治的病人身上提取一个体细胞，然后将该细胞的遗传物质植入一个去核卵母细胞内，培养发育形成囊胚。从囊胚内细胞团中提取到的胚胎干细胞，建立胚胎干细胞系，大量扩增的胚胎干细胞在一定条件下可定向诱导分化为人体所需要的，具有相同组织特异性的神经细胞、造血干细胞、成骨细胞、胰岛细胞和心肌细胞等成体细胞，临床移植不会产生移植排斥反应。另外，胚胎干细胞系可用于基因治疗等多种类型研究。申请专利技术1、建立克隆人自体基因的胚胎干细胞技术2、建立克隆人自体基因的胚胎干细胞系3、克隆人自体基因的胚胎干细胞定向诱导人成体细胞分化(1)定向诱导神经细胞分化技术(2)定向诱导造血干细胞分化技术(3)定向诱导成骨细胞分化技术(4)定向诱导心肌细胞分化技术(5)定向诱导胰岛细胞分化技术
技术实现思路
一、构建人自体基因的胚胎本文档来自技高网...

【技术保护点】
克隆人自体基因的胚胎干细胞定向诱导人成体细胞分化技术主要包括以下步骤：（１）、采用体细胞核移植克隆技术构建人自体基因的胚胎干细胞；（２）建立人自体基因的胚胎干细胞系；（３）人胚胎干细胞系的鉴定；（４）人自体基因的胚胎干细胞定向诱导成体细胞分化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李建远，王海燕，刘雪霞，王延伟，刘运祥，
申请(专利权)人：李建远，王海燕，刘雪霞，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]