由源于虹彩组织的神经干细胞生产网膜神经细胞的方法、以及由该方法得到的网膜神经细胞技术

本发明专利技术提供一种网膜神经细胞的生产方法以及由该生产方法得到的网膜神经细胞。本发明专利技术的网膜神经细胞的生产方法为，由虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞，从而来生产网膜神经细胞。其第１种方法为，对源于哺乳类的虹彩色素上皮细胞和源于鸟类的胚胎网膜干细胞实施共同培养。其第２种方法为，在分离了鸟类或哺乳类等的虹彩色素上皮细胞后，对该虹彩色素上皮细胞实施接触培养。根据上述方法，能够利用从患者自身采集的虹彩色素上皮细胞来生产网膜神经细胞，所以，可实现非常有效的再生治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种通过进行诱导分化从而由源于哺乳类或鸟类的虹彩组织的神经干细胞生产网膜神经细胞的方法、以及由该方法得到的网膜神经细胞。
技术介绍
近年来，神经干细胞在脑、脊髓中的存在已得到了证实，而且，有报告称ES(Embryonic Stem)细胞能够分化为特定的中枢神经系细胞，因此，人们对中枢神经系再生治疗的期待日渐高涨。另外，作为神经干细胞的分离和选择培养方法，已经确立了neurosphere法(浮游凝集块培养法)。此外，还有下述神经干细胞的诱导分化法，即，利用接触培养法来培养借助于上述浮游凝集块培养法形成神经干细胞的sphere(凝集块)，从而，将神经干细胞诱导分化为神经系细胞。另外，有报告称，将源于脑、脊髓的神经干细胞或ES细胞移植到活体内，由此，该所移植的细胞就适应环境而分化为特异性的神经细胞(参照非专利文献1Nature 414、112-117，review 2001年)。哺乳动物的网膜神经细胞一旦变性，将不能再生，并导致机能的降低。并且，如果因网膜变性疾患等而造成视细胞变性，则有可能导致失明。现在，对这种难症尚无有效的治疗方法。如果能够利用上述神经干细胞的诱导分化来生产网膜神经细胞，则将实现极为有效的再生治疗。作为用于上述网膜神经细胞的诱导分化的神经干细胞，有人提出了使用毛样体上皮细胞和网膜色素上皮细胞的方案。网膜色素上皮细胞和毛样体上皮细胞均来源于神经板。网膜色素上皮细胞由作为网膜的最外侧的细胞层的受容器层所覆盖，该网膜由多个细胞层构成。毛样体上皮是存在于虹彩与网膜的中间位置的组织。例如，在非专利文献2(Science 287、2032-2035页，2000年)中公开了下述方法，即，利用浮游凝集块培养法来培养毛样体上皮细胞并形成sphere(凝集块)，然后，使用接触培养法来培养该凝集块，从而对分化实施诱导。在非专利文献3(Biochem.And Biophys.Res.Commun.270、517-521页，2000年)中也揭示了能够由毛样体上皮细胞诱导分化网膜神经细胞的可能性。此外，在非专利文献4(Brain Res.677(2)、300-310页，1995年)中，通过培养实验揭示出，虽然是胚胎期的有限的时间，哺乳动物的网膜色素上皮细胞具有向神经细胞分化转换的能力。在非专利文献5(DNA Cell Biol 12(8)、667-673页，1993年)中也揭示了能够由网膜色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞的可能性。源于脑、脊髓的神经干细胞与ES细胞在再生治疗中的应用存在下述诸多问题，例如，因细胞移植带来的免疫排斥问题、伦理问题、作为移植材料的移植细胞源的供需失衡问题等。如果能够将源于移植对象个体自身的细胞用作中枢神经系再生的材料，则自身移植将成为可能，而上述问题也能够得以解决。但是，在应用于治疗时，由于很难获得患者本人的毛样体上皮细胞，所以，要想将毛样体上皮细胞用作中枢神经系再生的材料并非现实。此外，在非专利文献4中，揭示出只有在各组织中存在较多相对未分化的细胞的哺乳类的胚胎期的有限的时间内的网膜色素上皮细胞才具有向神经细胞分化转换的能力。也就是说，在哺乳动物成体的各组织中极少存在相对未分化的细胞，网膜色素上皮细胞在成体中也已经高度分化，所以，难以对细胞实施分离、培养。因此，就现阶段而言，不能够将哺乳动物成体的网膜色素上皮细胞用作中枢神经系再生的材料。另外，在非专利文献6(Biochem.and Biophys.Res Commun.297，177-184页，2002年)中揭示了由ES细胞生产网膜神经细胞的方法，但是，其效率极其低下。鉴于上述情况，眼球的虹彩色素上皮细胞就成为可望用作中枢神经系再生的材料的细胞的一种。虹彩色素上皮细胞是构建虹彩的细胞的一种，而该虹彩是用于根据光量来开闭瞳孔从而对到达网膜的光量进行调节的组织。关于虹彩色素上皮细胞的发生起源，与网膜色素上皮细胞和毛样体上皮细胞同样地，其也来源于神经板。由于能够从患者本人身上采集其一部分的虹彩色素上皮细胞，所以，可将上述虹彩色素上皮细胞作为可自身移植的再生材料来进行有效的利用。另外，虹彩色素上皮细胞的组织少，其细胞数量也较少，所以，难以对该虹彩色素上皮细胞进行分离培养。本申请专利技术人此前曾公开了成功地分离培养出鸡雏的虹彩色素上皮细胞的情况(参照非专利文献7(Experimental Cell Res.245，245-251页，1998年)。在该非专利文献7中，通过在一定培养条件下的实验，揭示出鸡雏的虹彩色素上皮细胞具有向晶体分化转换的能力。进而，本申请专利技术人通过改变上述非专利文献7的方法，使得对哺乳动物(小鼠、大鼠、人胎儿)的虹彩细胞的分离培养成为可能(参照非专利文献8(Nature Neuroscience 4<12>，1163页，2001年)。在上述非专利文献8中，在分离成体大鼠的虹彩组织并对其实施原代培养(Primary Culture)后，虽然确认了一部分细胞表达神经标记(Neural Marker)，但是，并未检测出特异性分化了的神经标记。为了得到网膜的视细胞，如果使所培养的虹彩细胞强制性表达用于暗示在视细胞的发育时期发挥重要作用的Crx基因，则可以确认所培养的虹彩细胞产生了感光功能所必需的视紫红质(Rhodopsin)蛋白质。根据上述非专利文献8，仅仅在使得强制性表达作为特异性基因的Crx基因的情况下，才诱导其向视细胞分化。但是，如果考虑到在治疗中的应用，借助于基因的强制性表达而实施的诱导分化会带来损伤DNA等的风险，所以，并非理想的方案。因此，就目前的现状而言，由源于虹彩组织的神经干细胞(虹彩色素上皮细胞)诱导分化网膜神经细胞，由此生产能够有效地用于再生治疗的网膜神经细胞的方法尚未被确立。如上上述，由于能够从患者本人身上采集其一部分细胞，所以，如果能够得到由虹彩色素上皮细胞诱导分化的网膜神经细胞，利用患者自身的细胞的再生治疗就能得以实现。并且，可以期待将会给现今尚无有效治疗方法的网膜变性疾患的治疗方法的确立作出重要的贡献。本专利技术是鉴于上述问题而进行开发的，目的是提供一种通过由具有能够有效地用于再生治疗的可能性的虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞而无需导入基因来生产网膜神经细胞的方法、以及由该方法得到的网膜神经细胞。
技术实现思路
本申请的专利技术人对上述课题进行潜心研究的结果，发现通过共同培养胚胎网膜干细胞及虹彩色素上皮细胞，或者，通过在培养基上对虹彩色素上皮细胞实施接触培养，无需导入基因就能诱导从虹彩色素上皮细胞向网膜神经细胞的分化，从而完成了本专利技术。本专利技术的网膜神经细胞的生产方法的特征在于共同培养胚胎网膜干细胞和虹彩色素上皮细胞，由虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞。根据本专利技术的网膜神经细胞的生产方法，通过共同培养胚胎网膜干细胞及虹彩色素上皮细胞，无需象现有技术(参照非专利文献8)那样地导入基因，就能进行向网膜神经细胞的诱导分化。因此，在将通过本专利技术的生产方法所得到的网膜神经细胞用作再生治疗的材料时，不会带来诸如损伤DNA等的危险，所以，具有可有效地用于再生治疗的可能性。另外，关于上述虹彩色素上皮细胞，如上上述，可从患者本人身上采集其一部分细胞，因此，通过本专利技术的生产方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种网膜神经细胞的生产方法，其特征在于：共同培养胚胎网膜干细胞和虹彩色素上皮细胞，由虹彩色素上皮细胞诱导分化网膜神经细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：小阪美津子，
申请(专利权)人：独立行政法人科学技术振兴机构，
类型：发明
国别省市：JP[日本]