胁迫－诱导的启动子及其使用方法技术

该发明专利技术提供了一种在象水稻这样的单子叶植物中能有效发挥作用的胁迫－诱导的启动子，以及使用该启动子的环境胁迫耐受植物。该启动子来自水稻并由下列ＤＮＡ（ａ）或（ｂ）组成：（ａ）由如ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１或１０所示的核苷酸序列组成的ＤＮＡ；或（ｂ）在严谨条件下，能与由ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１或ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１０所示的核苷酸序列组成的ＤＮＡ互补的核苷酸序列组成的ＤＮＡ杂交并表达胁迫－诱导的启动子活性的ＤＮＡ。上述环境胁迫耐受植物具有导入其中的上述启动子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种获自水稻的胁迫-诱导的启动子及其使用方法。现有技术植物具有耐受机制以应付自然界中不同类型的环境胁迫，例如脱水、高温、冷冻或盐胁迫。近年来，因为已在分子水平上阐明了胁迫耐受机制，因此可以利用生物技术的方法生产了胁迫耐受植物。例如，业已表明当细胞暴露于胁迫条件下，细胞中会诱导产生胁迫蛋白，例如LEA蛋白、水通道蛋白或能够作用于可混溶溶质的合酶，从而保护细胞免于上述胁迫的影响。因此，已有研究尝试过将大麦LEA蛋白的基因或烟草解毒酶的基因、作用于渗透调节物质(如，糖、脯氨酸或甜菜碱)的合酶的基因等导入到宿主植物中。也有尝试过利用编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)w-3脂肪酸脱氢酶的基因、蓝绿藻D9-脱氢酶的基因，或类似的细胞膜脂类修饰酶的基因的研究。在上述研究中，一个基因与花椰菜花叶病毒的35S启动子连接并导入植物中。但是，重组植物的胁迫耐受水平不稳定，并且导入基因的表达水平也很低。因此，这些都无法应用于实际应用中。另一方面，研究发现，胁迫耐受机制与几种基因关系错综复杂(Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.Plant Physiol.1997年10月；115(2)327-334页)。相应地，已有研究尝试了将编码转录因子并且同时激活上述几种基因表达的基因连接到一个组成型启动子上并导入植物中，从而增强植物的胁迫耐受力(Liu等，The Plant Cell，1998，101391-1406)。但是，当几种基因同时激活时，宿主植物的能量被导向于基因产物的合成或由基因产物产生的胞内代谢。相应地，植物自身生长变得延缓或生长矮小。相反地，本专利技术人从拟南芥中分离出编码与胁迫应答元件结合并且特异性激活该元件下游基因转录的转录因子的基因DREB1A、DREB1B、DREB1C、DREB2A和DREB2B(JP专利公开(未审查申请)No.2000-60558)。他们报道在一个植物中导入与一个胁迫诱导的rd-29A启动子连接的基因能够产生不影响植物生长的胁迫耐受植物(JP专利公开(未审查申请)No.2000-116260)。所述rd-29A启动子获自双子叶植物拟南芥。其也能够在单子叶植物中起作用，但是活性水平较低。相应地，在单子叶植物中具有高水平活性的胁迫-诱导的启动子已经成为很多研究的目标。
技术实现思路
本专利技术的目的是发现一种在象水稻这样的单子叶植物中能有效发挥作用的胁迫-诱导的启动子并提供一种利用该启动子的新的环境胁迫耐受植物。本专利技术人进行了集中的研究以求达到上述目的。结果，他们从水稻基因组中已成功地分离了一种强胁迫-诱导的启动子。他们还发现单子叶植物的环境胁迫耐受力通过使用该启动子可得到显著提高。从而完成了本专利技术。具体而言，本专利技术涉及一种获自水稻的胁迫-诱导的启动子。更具体地，该启动子由DNA(a)或(b)组成(a)由SEQ ID NO1或10所示的核苷酸序列组成的DNA；或(b)在严谨条件下，与能与由SEQ ID NO1或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列组成的DNA杂交、并表达胁迫-诱导的启动子活性的DNA。于此所用的术语“胁迫”是指脱水胁迫、低温胁迫或盐胁迫。本专利技术提供了一种包含上述启动子的重组载体。在根据本专利技术的启动子的控制下，该载体可包含其它结构基因或者调节基因。特别优选的是，该载体包含用于增强胁迫耐受性的结构基因和/或调节基因。用于增强胁迫耐受性的优选的结构基因的实例包括，P5CS基因，其是一种脯氨酸合成的关键酶(Yoshiba Y.等.，1999，BBRC 261)，和用于肌醇半乳糖苷合成的AtGol S3基因(Taji T.等.，2002，Plant J，29417-426)。用于增强胁迫耐受性的优选的调节基因的例子包括，拟南芥来源的DREB转录因子基因(JP专利公开(未审查的申请)No.2000-60558)，水稻来源的OsDREB转录因子基因(JP专利申请No.2001-358268，Dubouzet等.，Plant J.出版中)，以及NCED基因，其是一种植物激素ABA生物合成的关键酶(Iuchi S.等.，2001，Plant J.27325-333)。特别优选拟南芥来源的DREB转录因子基因和水稻来源的OsDREB转录因子基因。最优选水稻来源的OsDREB转录因子基因。本专利技术提供了一种转基因植物，其通过将本专利技术的载体导入到合适的宿主中而获得。根据本专利技术的一个实施方案，所述转基因植物通过将本专利技术的载体导入到一种宿主植物中而获得。在这种情况下，该宿主植物优选是单子叶植物，该单子叶植物优选是水稻。通过将本专利技术的启动子导入到植物中，本专利技术进一步提供了一种用于增强植物胁迫耐受力的方法。本专利技术的启动子表现出强的胁迫-诱导的启动子活性，该活性从未在单子叶植物中被观察到，因此本专利技术的启动子更适于增强单子叶植物的胁迫耐受力。附图简述附图说明图1表示当实施各种胁迫时，对a0022(LIP9)Northern分析的结果。图2表示a0022(LIP9)其启动子区的核苷酸序列。图3表示GUS表达构建体的结构，其中Tg7代表g7终止子，HPT代表潮霉素磷酸转移酶，Pnos代表Nos启动子，以及Tnos代表Nos终止子。图4是一个显示当实施脱水胁迫时，通过导入不同的连接到GUS基因的启动子制备的转基因烟草或水稻的GUS活性的图。图5是一个显示当实施盐胁迫时，通过导入一种连接到GUS基因的LIP9启动子制备的转基因水稻的GUS染色结果的图。图6显示了通过Northern方法分析导入的基因和靶基因(LIP9(a0022)，WSI724(a0066)，和salT(a2660))在转基因水稻和野生型水稻中表达水平的结果，其中“a，”“b，”和“c”各自分别代表一种转基因植物品系。图7表示a0066(WSI724)其启动子区的核苷酸序列。图8是一个显示当实施脱水胁迫时，通过导入一种连接到GUS基因的WSI724启动子制备的转基因水稻的GUS活性的图，其中右边的条代表当实施脱水胁迫时的GUS活性，左边的条代表对照。图9是一个显示当实施脱水胁迫时，通过导入一种连接到GUS基因的WSI724启动子制备的转基因水稻的GUS染色结果的照片。该说明书包括公开于日本专利申请No.2003-80847的说明书的部分或全部内容，其是本申请的优先权文件。专利技术的实施方案本专利技术的启动子是一种水稻来源的启动子，其特异性地由诸如低温、脱水或盐胁迫的环境胁迫所诱导。1.本专利技术启动子的鉴定本专利技术的启动子可鉴定如下。比较被实施胁迫和没有被实施胁迫的植物，以及首先，筛选以显著差异水平表达的基因(胁迫-诱导的基因)。随后，基于基因组信息，筛选被认定为基因启动子的序列。以下描述了本专利技术启动子的鉴定过程。1.1mRNA的制备首先，制备用于筛选胁迫-诱导的基因的mRNA。mRNA的来源可以是植物的局部，例如，叶子、茎、根或花朵，或者是植物整体。可选择地，可使用由播种到例如GM培养基、MS培养基或#3培养基这样的固体培养基上并无菌生长而获得的植物。其来源可以是愈伤组织或是无菌生长的植物的培养细胞。在该筛选过程中，观察给予胁迫的植物和没有给予胁迫的植物之间基因表达水平的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻来源的启动子，由下列ＤＮＡ（ａ）或（ｂ）组成：（ａ）由如ＳＥＱＩＤＮＯ：１或１０所示的核苷酸序列组成的ＤＮＡ；或（ｂ）在严谨条件下，与能与由ＳＥＱＩＤＮＯ：１或ＳＥＱＩＤＮＯ：１０所示的核苷酸序列组成的ＤＮＡ互补的核苷酸序列组成的ＤＮＡ杂交并表达胁迫－诱导的启动子活性的ＤＮＡ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：筱崎和子，桂幸次，伊藤裕介，
申请(专利权)人：独立行政法人国际农林水产业研究中心，独立行政法人农业生物系特定产业技术研究机构，
类型：发明
国别省市：JP[日本]