一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法。具体步骤如下：取玉米种子50粒，用刀片将胚上方的种皮划开；用有效氯为1%的次氯酸钠消毒液进行种子消毒，备用；用基因工程的方法将扩增后的番茄PDS基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中；农杆菌转化及培养；配制转化菌液；玉米种子侵染。玉米基因组复杂，突变体不易获得，遗传转化困难且受基因型限制，本发明专利技术首创利用利用TRV、采用番茄PDS病毒基因对玉米种子进行病毒载体的侵染，进而实现玉米PDS基因沉默，本发明专利技术方法简便、快捷、高效、低成本、不需要基因转化，且本发明专利技术为全株沉默，效率高，方便研究目的基因在各个组织中功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法。背景介绍植物突变体很难获得，有些基因的突变对植物可能是致死的，基因沉默相对容易获得，病毒诱导的基因沉默(Virus-inducedgenesilencing,VIGS)是一种转录后基因沉默技术，作为一种有效的反向遗传学技术已经广泛应用于植物基因工程的研究中，其作用原理是植物在抵御病毒侵染时会启动RNA沉默(RNAsilencing)机制。植物体内的Dicer-likeprotein4可以识别病毒复制过程中产生dsRNA，并将其切割成21-24nt的siRNAs(smallinterferingRNAs)，siRNAs中的一条链与Agronatue(AGO)等蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)，并特异的与同源的靶标mRNA结合最终导致靶标mRNA的降解，这一过程即病毒诱导的基因沉默。同样的，如果将寄主植物基因的片段克隆岛病毒VIGS载体中，当寄主植物通过RNA沉默引起防御反应时，相应的寄主基因也会被沉默。一系列改造过的RNA或DNA病毒载体被用于VIGS(BeckerandLange,2010)。烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)是一类应用比较广泛而且效率和持久性较好的病毒载体，能够介导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状。改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染，也可以鉴定宿主植物生长点的基因，因此TRV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。玉米(学名：Zeamays)，亦称玉蜀黍、包谷、苞米、棒子。粤语称为粟米，闽南语称作番麦。是一年生禾本科草本植物，是重要的粮食作物和重要的饲料来源，也是全世界总产量最高的粮食作物。玉米也是我国重要的粮食作物，玉米基因组测序的初步完成为玉米功能基因组学的研究提供了重要的参考(Schnableetal.,2009)。但是玉米基因组复杂，突变体不易获得，遗传转化困难，受基因型限制等这些对玉米基因功能的研究带来了诸多不便。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种快速方便的玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默方法及应用，能够快速高效的在整个玉米植株中沉默目的基因。一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，具体步骤如下：步骤(1)：取玉米种子50粒，用刀片将胚上方的种皮划开；用有效氯为1％的次氯酸钠消毒液进行种子消毒，备用；步骤(2)：用基因工程的方法将扩增后的番茄八氢番茄红素脱氢酶(下称：番茄PDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV-SlPDS；具体步骤如下：cDNA合成：按TaKaRa提取试剂盒操作说明提取番茄的总RNA，以1μg的总RNA做模板，按照TaKaRacDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，然后稀释10倍备用；PDS基因扩增：设计引物，上游引物5’-CGGGGTACCGGCACTCAACTTTATAAACC-3’和下游引物5’-CGGGGATCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC-3’，以番茄的cDNA第一链为模板、用KAPAHiFiPCRKits的50μL体系进行扩增；扩增程序为95℃预变性3min；30个循环的98℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；番茄的cDNA经PCR扩增后的产物为409-bp番茄PDS基因片段；pTRV-SlPDS质粒构建：纯化后的PCR基因片段经KpnI-BamHI双酶切后，与经KpnI-BamHI双酶切的pTRV2质粒用T4-DNA连接酶连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50mg/LKan抗生素的LB平板培养基，37℃倒置过夜培养，长出单克隆，挑取单克隆至含有50mg/LKan抗生素的液体LB培养基中，37℃，250转每分钟震荡培养12小时，提取质粒，验证正确后，备用；步骤(3)农杆菌转化及培养：3.1)将验证正确的pTRV-SlPDS、pTRV2以及pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，所述的液氮冻融法具体方法为：取农杆菌GV3101感受态细胞，冰上融化，加入200纳克待转质粒，冰浴30分钟，液氮速冻2分钟，37℃水浴锅水浴2分钟，冰浴2分钟，加入800微升无抗LB液体培养基，28℃180转每分钟震荡培养3小时，涂布于含有50mg/LKna和50mg/LRif抗生素的固体LB培养基上，28℃倒置避光培养3天长出单克隆；挑取单克隆于含有50mg/LKan和50mg/LRif抗生素的液体LB培养基中，28℃200转每分钟震荡培养24小时，经菌液PCR鉴定合格后，得到含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV1、TRV2和TRV-SlPDS，保菌备用；3.2)将含有TRV1、TRV2、TRV-SlPDS质粒的农杆菌GV3101菌液，分别在含有抗生素的LB平板培养基上划线，28℃倒置避光培养3天长出单克隆；3.3)分别挑取3.2)中的单克隆放于含有抗生素的LB液体培养基中，用离心管在28℃、200转/min条件下，震荡培养24小时，以实现单克隆的增殖；3.4)将3.3)得到的TRV1与TRV2单克隆培养液以1：1混合，TRV1与TRV-SlPDS单克隆培养液以1:1混合，分别按1:100转接到相同的LB培养基上，在三角瓶中继续培养到菌液的O.D.600＝0.04-1.5，并调整两个三角瓶中的菌液的O.D.600值相同；步骤(4)配制转化菌液：向步骤(3)所得的菌液中加入乙酰丁香酮(AS)终浓度为19.62mg·L-1、半胱氨酸(Cys)终浓度为400mg·L-1和吐温20(Tween20)终浓度为5ml·L-1，均匀混合得到含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；步骤(5)玉米种子侵染：将等量的处理过的玉米分别放入带橡胶塞的10ml玻璃瓶中，记为玻璃瓶1和2，玻璃瓶1中加入5ml含TRV1与TRV2的转化菌液，玻璃瓶2中加入5ml含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，使种子完全浸泡在转化菌液中；用20ml注射器对玻璃瓶抽真空，每次保持15s，操作1～4次；最后，分别将玻璃瓶1、玻璃瓶2中的玉米种子和转化菌液倒入步骤(4)相应的剩余转化菌液中，在28℃、200转每分钟下过夜培养0-25小时；培养结束，超净台中用无菌水清洗干净，将经TRV1与TRV2以1：1混合侵染过的玉米和经TRV1与TRV-SlPDS以1：1混合侵染过的玉米清洗干净，分别转接到相同的固体MS培养基上，培养条件为：19-22℃，光照强度为150μmol·m-2·s-1，光周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为55％，培养至长出叶片，移栽至土壤中继续生长两周后观察表型，提取DNA采用TRV壳蛋白基因检测番茄PDS病毒的扩增情况，提取RNA使用半定量RT-PCR方法检测被沉默玉米中PDS基因转录本的沉默效果。进一步，步骤(3)中，100ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤(1)：取玉米种子50粒，用刀片将胚上方的种皮划开；用有效氯为1％的次氯酸钠消毒液进行种子消毒，备用；步骤(2)：用基因工程的方法将扩增后的番茄八氢番茄红素脱氢酶(下称：番茄PDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV‑SlPDS；步骤(3)农杆菌转化及培养：3.1)将pTRV‑SlPDS、pTRV2以及pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，经菌液PCR鉴定正确后，得到分别含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV‑SlPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV1、TRV2和TRV‑SlPDS，保菌备用；3.2)将含有TRV1、TRV2、TRV‑SlPDS质粒的农杆菌GV3101菌液，在含有抗生素的LB平板培养基上培养长出单克隆；3.3)分别挑取3.2)中的单克隆放于含有抗生素的LB液体培养基培养，以实现单克隆的增殖；3.4)将3.3)得到的TRV1与TRV2单克隆培养液以1：1混合，TRV1与TRV‑SlPDS单克隆培养液以1:1混合，分别按1:100转接到相同的LB培养基上，在三角瓶中继续培养到菌液的O.D.600＝0.04‑1.5，并调整两个三角瓶中的菌液的O.D.600值相同；步骤(4)配制转化菌液：向步骤(3)所得的菌液中加入乙酰丁香酮、半胱氨酸和吐温20，均匀混合得到含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV‑SlPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；步骤(5)玉米种子侵染：含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV‑SlPDS的转化菌液侵染步骤(1)处理过的玉米种子，继续培养，观察表型，提取RNA使用半定量RT‑PCR方法检测被沉默玉米中PDS基因转录本的沉默效果。...

【技术特征摘要】
1.一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤(1)：取玉米种子50粒，用刀片将胚上方的种皮划开；用有效氯为1％的次氯酸钠消毒液进行种子消毒，备用；步骤(2)：用基因工程的方法将扩增后的番茄八氢番茄红素脱氢酶(下称：番茄PDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV-SlPDS；步骤(3)农杆菌转化及培养：3.1)将pTRV-SlPDS、pTRV2以及pTRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，经菌液PCR鉴定正确后，得到分别含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS的农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV1、TRV2和TRV-SlPDS，保菌备用；3.2)将含有TRV1、TRV2、TRV-SlPDS质粒的农杆菌GV3101菌液，在含有抗生素的LB平板培养基上培养长出单克隆；3.3)分别挑取3.2)中的单克隆放于含有抗生素的LB液体培养基培养，以实现单克隆的增殖；3.4)将3.3)得到的TRV1与TRV2单克隆培养液以1：1混合，TRV1与TRV-SlPDS单克隆培养液以1:1混合，分别按1:100转接到相同的LB培养基上，在三角瓶中继续培养到菌液的O.D.600＝0.04-1.5，并调整两个三角瓶中的菌液的O.D.600值相同；步骤(4)配制转化菌液：向步骤(3)所得的菌液中加入乙酰丁香酮、半胱氨酸和吐温20，均匀混合得到含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液，放置于超净工作台中备用；步骤(5)玉米种子侵染：含TRV1与TRV2的转化菌液和含TRV1与TRV-SlPDS的转化菌液侵染步骤(1)处理过的玉米种子，继续培养，观察表型，提取RNA使用半定量RT-PCR方法检测被沉默玉米中PDS基因转录本的沉默效果。2.根据权利要求1所述的玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，其特征在于，步骤(2)的详细操作步骤如下：cDNA合成：按TaKaRa提取试剂盒操作说明提取番茄的总RNA，以1μg的总RNA做模板，按照TaKaRacDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，然后稀释10倍备用；PDS基因扩增：以番茄的cDNA第一链为模板、用KAPAHiFiPCRKits，50μL体系进行扩增；设计引物，上游引物5’-CGGGGTACCGGCACTCAACTTTATAAACC-3’和下游引物5’-CGGGGATCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC-3’；PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；pTRV-SlPDS基因沉默载体的构建：纯化后的PCR基因片段，经KpnI-BamHI双酶切后，与经KpnI-BamHI双酶切的pTRV2质粒用T4DNA连接酶连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，构成pTRV-SlPDS基因沉默载体。3.根据权利要求2所述的玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李成伟，张菊，于德水，王健，陈璨，刘坤，徐克东，张怡，谭光轩，张福丽，廖立冰，
申请(专利权)人：周口师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41