本发明专利技术公开了一种调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2的应用。调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2在调控植物开花中的应用。将GmPUB2基因通过植物表达载体转入目的植物内获得晚开花植物。将GmPUB2基因通过基因沉默载体转入目的植物内获得早开花植物。将目标基因GmPUB2转入拟南芥。通过与野生型拟南芥相比，证明转基因植株的抽薹及开花时间明显晚于野生型，说明GmPUB2基因有推迟植物开花的作用。利用构建的GmPUB2基因沉默载体，对过表达目标基因GmPUB2的转基因拟南芥进行沉默，证明沉默后的植株开花时间明显早于对照植株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程
，涉及一种调控植物开花的大豆E3泛素连接 酶基因 GmPUB2的应用。
技术介绍
开花是植物从营养生长向生殖生长转变的重要过程，开花时间是一个重要的农艺 性状，它决定着作物是否适应于特定地区的光温及生长栽培季节。植物开花是植物从营养 生长到生殖生长转折的关键点，具有很强的可塑性。在各种外界环境和内部因子的影响下， 植物会选择在适当的时间开花而转入生殖生长。通过调节开花期，使植物延迟或提前开花， 可以控制植物的营养生长或生殖生长，避免冷害或其它逆境对作物的伤害，同时可以有效 地利用土地资源，进行合理的轮作。在最适合的时期开花可以达到最大的效益，促进光合产 物的积累、分配及有效利用，对提高作物产量意义重大。 在长期的进化过程中，植物形成了一套完整的机制，用于调节自身的生长发育以 适应或抵御外界生物和非生物胁迫。在这些进程中，E3泛素连接酶是泛素-26S蛋白酶系 统中决定识别特异性底物的关键因子，该系统是目前已知所有真核生物体内具有高度选择 性的最为重要的蛋白质降解途径，细胞内许多生命进程的蛋白质均可被泛素化途径修饰和 降解，包括生物与非生物逆境抗性、细胞周期、信号传导和转录等。近年来，E3泛素连接酶 在植物对生物和非生物胁迫响应调控中的功能得到越来越多的研究，其在植物生长发育的 调控也逐渐被人们所认知，但未见大豆E3泛素连接酶参与调控植物开花的报道。因此，研 究大豆E3泛素连接酶基因在植物开花调控网络中的作用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种控植物开花的大豆E3泛素 连接酶基因 GmPUB2。 本专利技术的另一目的是提供该基因编码的蛋白。 本专利技术的又一目的是提供该基因的应用。 调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因 GmPUB2在调控植物开花中的应用。 调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因 GmPUB2在培育晚开花植物中的应用。具 体是将GmPUB2基因通过表达载体转入目标植物内。所述植物优选是模式植物拟南芥。所 述GmPUB2基因 cDNA核甘酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因 GmPUB2在培育早花植物中的应用。具体 是将GmPUB2基因通过沉默载体转入目标植物内。所述植物优选是模式植物拟南芥。 含有所述的调控植物开花的大豆E3泛素连接酶基因 GmPUB2的表达载体在培育晚 开花植物中的应用。本专利技术提供了含有上述大豆E3泛素连接酶基因 GmPUB2的表达载体 pMDC83 -CaMV35S -GmPUB2。将 GmPUB2 基因克隆到 pMDC83,获得 pMDC83 -CaMV35S -GmPUB2。 GmPUB2基因的沉默载体在培育早开花植物中的应用。本专利技术提供了含有上述大豆 E3泛素连接酶基因 GmPUB2的沉默载体TRV :GmPUB2。将GmPUB2基因构建到TRV介导的沉 默载体中，获得TRV :GmPUB2。 本专利技术的有益效果： 利用现有的植物基因工程技术，并通过根癌农杆菌介导的子叶节转化法将目标基 因 GmPUB2转入拟南芥。通过与野生型拟南芥相比，证明转基因植株的抽薹及开花时间明显 晚于野生型，说明GmPUB2基因有推迟植物开花的作用。利用构建的GmPUB2基因沉默载体， 对过表达目标基因 GmPUB2的转基因拟南芥进行沉默，证明沉默后的植株开花时间明显早 于对照植株。【附图说明】 图1转GmPUB2基因拟南芥目标基因的检测 WT为野生型植株，L1、L2、L3和L4为转基因株系。 图2野生型植株和转基因株系中GmPUB2的表达量对比 WT为野生型植株，LU L2、L3和L4为转基因株系，GmPUB2/ACT表示大豆基因 GmPUB2的荧光定量表达量与拟南芥内参基因 Actin表达量的比值。 图3野生型拟南芥与转GmPUB2基因拟南芥的抽薹情况对比 图中上中下3层分别表示野生型拟南芥与GmPUB2转基因拟南芥在第26天、第27 天和第28天的抽薹情况。 图4野生型拟南芥与转GmPUB2基因拟南芥第25天的开花情况 WT为野生型植株，L3和L4为转基因株系，白圈标记的是第25天野生型植株和转 基因株系已开花的植株。 图5转基因拟南芥中的GmPUB2基因沉默后的开花时期 空白对照表示未作任何处理的转基因拟南芥，沉默空载对照表示转基因拟南芥用 空白沉默载体进行处理，沉默GmPUB2基因表型指转基因拟南芥用含有目标基因的沉默载 体进行处理后的表现情况。 图6转GmPUB2基因拟南芥和转基因拟南芥GmPUB2沉默株系中GmPUB2的表达量 检测 CK为转基因拟南芥植株，VIGS为转基因拟南芥沉默株系，GmPUB2/ACT表示大豆基 因 GmPUB2的荧光定量表达量与拟南芥内参基因 Actin表达量的比值。星号代表差异的显 著性（*Ρ〈0· 05 ;**Ρ〈0· 01)【具体实施方式】 （结合附图具体说明） 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。 实施例1 :GmPUB2基因的获得 I. RNA 提取： (1)样品处理：采集约IOOmg的大豆叶片组织在液氮中磨碎，加入ImL裂解液RZ， 晃动混匀。 (2)将匀浆样品在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。 (3) 4°C，12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无 RNase的离心管中。 (4)加入200 μ 1氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。 (5)4°C，12000rpm离心10min，样品会分成三层：RNA主要在水相中，把水相转移到 新管中，进行下一步操作。 (6)缓慢加入0. 5倍体积无水乙醇，混匀后转入吸附柱CR3中，4°C，12000rpm离心 30sec，弃掉收集管中的废液。 (7)向吸附柱CR3中加入500 μ1去蛋白液RD，4°C，12000rpm离心30sec，弃废液， 将CR3放入收集管中。 (8)向吸附柱CR3中加入700 μ 1漂洗液RW，室温静置2min，4°C，12000rpm离心 30sec，弃废液。 (9)重复操作步骤8 (10)将吸附柱放入2ml收集管中，4°C，12000rpm离心2min，去除残余液体。 (11)离心后将吸附柱CR3在室温放置片刻，以充分晾干。 (12)将吸附柱CR3转入一个新的I. 5ml离心管中，加65 μ I RNase - Free ddH20， 室温放置2min，4°C，12000rpm离心2min。收集溶解的RNA，保存于-80°C备用。 2. cDNA 的合成： (1)取-80°C保存的RNA(彡2 μ g)冰上溶解。配置下列反应体系： (2)轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下： 37 〇C 15min (反转录反应） 85〇C 5sec (反转录酶的失活反应） 4 〇C 2min ⑶-20°C保存备用。 3. cDNA 的克隆 (I)PCR 扩增 根据大豆的全基因数据库（http://phytozome. jgi. doe. gov/pz/portal. html)，利 用 Primer5. 0 软件设计特异性引物：上游引物 Fl :5' - GATACATAGAMCAATCGMATT本文档来自技高网...
【技术保护点】
cDNA序列如SEQ ID NO.1所示的大豆E3泛素连接酶基因GmPUB2在调控植物开花中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：智海剑，王大刚，王丽群，何卓伟，杨永庆，杨云华，林静，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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