沉默人的HAVCR2基因的siRNA、重组载体及用途制造技术

本发明专利技术涉及沉默人的HAVCR2基因的s iRNA及其用途，所述s iRNA具有如SEQ ID NO.1的序列。本发明专利技术还提供了含上述沉默人的HAVCR2基因的s iRNA重组载体及其用途，通过将含有s iRNA的重组载体转染到人的HAVCR2过表达型细胞中，获得稳定的克隆体，利用RNA干扰技术阻断HAVCR2的表达。本发明专利技术提供的沉默人的HAVCR2基因的s iRNA、重组载体可为人的HAVCR2基因功能的研究提供有效技术工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和生物制药
，具体涉及沉默人的HAVCR2基因的siRNA、重组载体及用途。
技术介绍
RNAi是一种转录后基因沉默机制，它通过双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)引起序列同源的mRNA(microRNAs)降解，来降低目标基因的表达，这个现象在进化过程中保守而且广泛。目前RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，为分析基因功能和信号传导通路以及基因治疗提供了一种新的研究手段，于2006年获得诺贝尔奖。RNAi具有以下特征优势：1.作用的特异性，只对与其同源的mRNA产生抑制作用，碱基错配会大大降低抑制效率；2.RNAi具有高度有效性，相对少量的“小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)”就可以几乎完全抑制靶基因的表达。在活体细胞中输送siRNA的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆入质粒载体。当送入细胞体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个双链的小发夹或短发夹RNA(asmallhairpinRNAorshorthairpinRNA，shRNA)，并被RNAi通道处理，之后结合到RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，这种复合物能够结合并切割与siRNA序列匹配的mRNA，导致mRNA无法翻译成相应蛋白质，最终沉默细胞中相应蛋白的表达。shRNA包括两个短的反向重复序列，中间为茎环(loop)序列，反向重复序列与茎环序列形成一发夹结构。甲型肝炎病毒受体2(HAVCR2)即Tim3蛋白，是TIM3基因编码的一种参与细胞免疫调控的细胞膜受体蛋白，是适应性免疫反应的重要负性调节分子，在炎症性疾病中发挥重要作用，其表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞及单核细胞/巨噬细胞等。Ju等(JuY,HouN,ZhangXN,etal.BlockadeofTim-3pathwayamelioratesinterferon-gammaproductionfromhepaticCD8+TcellsinamousemodelofhepatitisBvirusinfection[J].CellMolImmunol，2009，6(1)：35-43.)研究发现慢性乙肝患者外周血单核细胞(尤其是NK细胞和CD8+T细胞)和肝脏内单核细胞上Tim-3表达显著增高，这提示Tim-3蛋白很可能在乙肝病毒(HBV)感染的过程中同样发挥着重要的作用。
技术实现思路
针对基因研究的需要，本专利技术的一个目的是提供一种沉默人的HAVCR2基因的siRNA，其能有效抑制HAVCR2过表达型肝细胞中HAVCR2基因的表达，可为人HAVCR2基因功能的研究提供有效技术工具。本专利技术的第二个目的是提供上述沉默人的HAVCR2基因的siRNA的用途。本专利技术的第三个目的是提供一种沉默人的HAVCR2基因的siRNA的重组载体。本专利技术的第四个目的是提供上述沉默人的HAVCR2基因的siRNA的重组载体的用途。为达到以上目的，本专利技术采用的技术方案是：沉默人的HAVCR2基因的siRNA，具有如SEQIDNO.1的序列。本专利技术提供的沉默人的HAVCR2基因的siRNA的用途为其在制备HAVCR2基因沉默细胞模型中的用途。本专利技术提供的沉默人的HAVCR2基因的siRNA的重组载体，含有上述的沉默人的HAVCR2基因的siRNA。进一步，所述重组载体采用两步法构建获得，具体构建方法是：第一步，体外化学合成HAVCR2基因的siRNA表达模板单链，在退火缓冲液中退火形成双链DNA；第二步，将形成的双链DNA克隆入表达载体，从而构建成重组载体。再进一步，所述表达载体为siRNA真核表达载体Psilencer2.1-U6、pGCsi-U6/Neo/GFP、pGenesil-1.1或慢病毒载体pGC-LV。本专利技术提供的沉默人的HAVCR2基因的siRNA的重组载体的用途为其在制备HAVCR2基因沉默细胞模型中的用途。本专利技术所提供的能有效沉默人的HAVCR2基因表达的siRNA及含有该siRNA的重组载体，能有效抑制HAVCR2过表达型肝细胞中HAVCR2基因的表达，可为人HAVCR2基因功能的研究提供有效技术工具。附图说明图1为采用WesteernBlot检测法检测人的HAVCR2过表达型293T细胞的HAVCR2-GFP融合蛋白时获得的X光片显影图，GAPDH为用于测定HAVCR2相对表达量的内参，第“1”列对应于转染了对照质粒pGC-NC-siRNA的HAVCR2过表达型293T细胞对照组所在泳道，第“2”列对应于转染了质粒pGC-HAVCR2-siRNA的HAVCR2过表达型293T细胞实验组所在泳道。具体实施方式以下将参照附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1本实施例用于说明本专利技术提供的沉默人的HAVCR2基因的siRNA的构建方法。根据Genbank中报道的HAVCR2基因的核苷酸序列，参考siRNA设计原则设计出1条抑制HAVCR2基因表达的siRNA靶点序列，为SEQIDNO.1，同时设计随机对照序列SEQIDNO.2，如下所示：SEQIDNO.1：UUGGGUUGUCGCUUUGCAA；SEQIDNO.2：UUCUCCGAACGUGUCACGU。经Blast基因同源性分析，SEQIDNO.1序列不与任何人类非HAVCR2基因序列同源，以确保基因抑制的特异性。针对上述靶点序列，参考siRNA的设计策略,分别设计一对shRNA序列(SEQIDNO.1’)和一对随机对照序列(SEQIDNO.2’)，如下所示：SEQIDNO.1’：正义链：5’-CcggTTGGGTTGTCGCTTTGCAACTCGAGTTGCAAAGCGACAACCCAATTTTTg-3’反义链：5’-aattcaaaaaTTGGGTTGTCGCTTTGCAACTCGAGTTGCAAAGCGACAACCCAA-3’SEQIDNO.2’：正义链：5’-ccggCATTCTCCGAACGTGTCACGTCTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
沉默人的HAVCR2基因的siRNA，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1的序列。

【技术特征摘要】
1.沉默人的HAVCR2基因的siRNA，其特征在于，具有如SEQIDNO.1
的序列。
2.权利要求1所述的沉默人的HAVCR2基因的siRNA在制备HAVCR2基因
沉默细胞模型中的用途。
3.沉默人的HAVCR2基因的siRNA的重组载体，其特征在于，所述重组
载体含有权利要求1所述的沉默人的HAVCR2基因的siRNA。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体采用两
步法构建获得，具体构建方法是：第一步，体外化学合成HAVCR2基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：党旭红，左雅慧，原雅艺，刘建功，张慧芳，林海鹏，李幼忱，段志凯，刘红艳，张忠新，
申请(专利权)人：中国辐射防护研究院，
类型：发明
国别省市：山西;14