本申请属于生物制药技术领域，具体涉及一种沉默TNFAIP8基因的方法及其在肿瘤治疗中提高顺铂(CDDP)治疗效果的应用。沉默TNFAIP8基因的方法具体包括：设计siRNA靶序列、设计并合成shRNA基因序列、退火处理形成双链、与LV10载体连接、转化293T细胞制备慢病毒颗粒等步骤。将该方法沉默肿瘤细胞中的TNFAIP8基因后，可提高肿瘤细胞对CDDP的敏感性。本发明专利技术可有针对性地降低肿瘤细胞中TNFAIP8基因表达量；进一步地对TNFAIP8基因沉默的肿瘤细胞应用CDDP治疗时，肿瘤细胞对CDDP敏感性得到了明显提升。
【技术实现步骤摘要】
本申请属于生物制药
，具体设及一种沉默7??//?基因的方法及其在肿 瘤治疗中提高顺销（CDDP)治疗效果的应用。
技术介绍
手术、化疗和放疗仍是目前多种肿瘤治疗的主要手段，其中化疗作为肿瘤治疗的 常规手段之一，在许多恶性肿瘤的治疗过程中具有不可替代的作用。一般而言，随着化疗时 间的延长，肿瘤细胞对化疗药物的抵抗上升和敏感性下降是不可避免的现象，因而也是目 前肿瘤药物研发和肿瘤治疗中急需解决的问题。 顺销（cis-diaminedichloroplatinum,CDDFO为无机销的金属络合物，其结构 中包含有一个中屯、二价销及周围顺式排列的两个氨分子和两个氯原子，类似于双功能烧化 剂，可与DNA形成链内和链间交叉联结，破坏DNA功能，阻止DNA复制，属于一种细胞周期非 特异性药物。它具有抗瘤谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用等特点，因而是临床肿 瘤治疗中最常用的化疗药物之一。 临床应用中，随着化疗时间的延长和多次应用顺销，肿瘤细胞可对顺销的敏感性 下降和产生顺销抵抗，使得治疗效果大大降低。而且，顺销也具有较大的副作用，比如严重 的恶屯、、呕吐，肾毒性、神经毒性、骨髓抑制等。因而目前临床上主要采用顺销和其他化疗药 物联合应用来增强治疗效果和降低药物抵抗的发生率。 TNFAIP8(Tumornecrosisfactoralphainducedprotein8，TIPE)即TNF-口 诱导的蛋白质8，也被称作SCC-C2，ND邸，GG2-1，是一种分子量为2化D的胞浆蛋白。已有研 究表明，胃77?基因开放阅读框架中包含一和死亡效应结构域謹同源的序列，属于Fas相 关死亡结构域蛋白样白介素-10转换酶抑制蛋白（Fasassociateddeathdomain-l;Lke interleukin-10 -convertingenzyme-inhibitoryprotein,FLIP)家方矣的成员 (KumarDet.al.，IdentificationofaNovelTumorNecrosisFactor-a-inducible Gene,SCC-S2,ContainingtheConsensusSequenceofaDeathEffectorDomainof Fas-associatedDeathDomain-likeInterleukin-I0-convertingEnzyme-inhibitory Protein，J.Biol.Chem. ,2000,275 (4) :2973-2978)。另有研究表明，TNFAIP8 在多种肿 瘤组织中的表达显著高于癌旁组织和正常对照组织。因而关于TNFAIP8与肿瘤的相关性尚 待进一步研究，而关于调节TNFAIP8的表达量在肿瘤治疗中的应用更是缺乏相关的研究报 道。
技术实现思路
本专利技术主要目的是提供一种沉默7??//?基因的方法，通过沉默7??//?基因用 于肿瘤治疗时，可提高顺销（CDDP)的治疗效果。 下面对本专利技术的技术方案详细介绍如下。 -种沉默7??//?基因的方法，技术原理为，通过构建携带有ShRNA的慢病毒载 体，然后利用慢病毒颗粒感染肿瘤细胞，使肿瘤细胞内的7??//?基因沉默；具体过程为： (1) 设计沉默7??//?基因的SiRNA祀序列 使人別剧//?基因（GenBank:CR457137. 1)沉默的SiRNA(SmallintederingRNA) 祀序列，具体为： SiRNA祀序列为：5, -GCCACCACCTTAATAGACGAC- 3' ； 依据SiRNA祀序列设计并合成ShRNA基因序列，详细序列如下： 正义链序列为：5'-TGCCACCACCTTAATAGACGACTTCAAGAGAGTCGTCTATTAAGGTGGTGGCTTT TTTC- 3^ ； 正义链的5'端添加了T，与化al酶切后形成的粘端互补； 反义链序列为： 5 ^ -TCGAGAAAAAAGCCACCACCTTAATAGACGACTCTCTTGAAGTCGTCTATTAAGGTGGTGGCA- 3^ ； 反义链5'端添加了AGCT，与化Ol酶切后形成的粘端互补； 需要说明的是，ShRNA序列中的loop结构选用了TTCAAGAGAW避免形成终止信号； (2) 将上述步骤（1)中所合成的ShRNA正义链序列和反义链序列进行退火处理形成双 链； (3) 对LVlO载体采用化Ol酶和化aI酶进行线性化处理； (4) 将步骤（2)和步骤（3)产物进行连接构建LVlO-ShRNA载体； (5) 将步骤（4)所构建的LVlO-ShRNA载体转化293T细胞制备慢病毒颗粒； 将所制备的慢病毒颗粒感染肿瘤细胞后即可使肿瘤细胞中TNFAIP8基因沉默，所述肿 瘤细胞具体例如人肿瘤细胞系的化La、化299、U251或EC9706。 所述沉默7??//?基因的方法在肿瘤中的应用，沉默肿瘤细胞中的7??//?基因 后，可提高肿瘤细胞对顺销（CDDP)的敏感性，提高CDDP的治疗效果。 现有肿瘤治疗中，由于C孤P应用较为广泛，且具有较为确切的治疗效果，因而为 适应CDDP的应用，同时为降低CDDP的副作用，需要提高肿瘤细胞对CDDP的敏感性，同时较 低用量的CDDP也可降低CDDP使用时的副作用。 本专利技术通过构建含有特定ShRNA序列的慢病毒载体和制备慢病毒颗粒，将其用于 肿瘤细胞时，可有针对性地降低肿瘤细胞中7??//?基因表达量。进一步地对7??//?基 因沉默的肿瘤细胞应用CDDP治疗时，肿瘤细胞对CDDP敏感性得到了明显提升。本专利技术为 肿瘤的治疗提供了新的借鉴和参考，同时为CDDP在肿瘤治疗中的应用提供了新的前景和 可能性。【附图说明】 图1为慢病毒颗粒感染肿瘤细胞后，7??//?基因及其蛋白表达检测结果，其中1 为野生型细胞，2为阴性对照组细胞，3为基因沉默组细胞；图A为实时巧光定量PCR检测 7??//?钓mRNA在肿瘤细胞中的相对表达量，其中野生型细胞中7??//?钓mRNA表达量假 设为1，结果为7??//?基因沉默细胞和阴性对照细胞相对于野生型细胞中7??//?钓表达 倍数；图B为Westernblot检测肿瘤细胞中TNFAIP8的蛋白表达水平结果； 图2为MT法检测时7??//?基因沉默肿瘤细胞对不同浓度CDDP处理时的敏感性差 另IJ，其中scr为阴性对照组；SiTI阳为基因沉默组； 图3为流式细胞仪检测时，7??//?基因沉默肿瘤细胞对特定浓度CDDP敏感结果，其 中scr为阴性对照组；SiTI阳为基因沉默组； 图4为台吩蓝染色法检测时，7??//?基因沉默肿瘤细胞对不同浓度CDDP敏感结果， 其中scr为阴性对照组；SiTI阳为基因沉默组。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步的解释说明。介绍具体实施例前，对本专利技术所 用到的主要仪器设备及实验试剂简要介绍如下。 主要试剂、药品及样品： 人非小细胞肺癌NCI-H1299、人胶质瘤细胞U251、人子宫颈癌细胞化La、人食管癌细胞EC9706J93T细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中屯、；ToplO感受态细胞 购自天根生化科技(北京）有限公司。[001引嚷岭霉本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种沉默TNFAIP8基因的方法，其特征在于，该方法具体过程为：（1）设计沉默TNFAIP8基因的siRNA靶序列；使人TNFAIP8基因沉默的siRNA靶序列，如SEQ ID.1所示，具体为：siRNA靶序列为：5’‑ GCCACCACCTTAATAGACGAC ‑ 3’；依据siRNA靶序列设计并合成shRNA基因序列，如SEQ ID.2所示，具体序列如下：正义链序列为： 5’‑TGCCACCACCTTAATAGACGACTTCAAGAGAGTCGTCTATTAAGGTGGTGGCTTTTTTC‑ 3’；反义链序列为：5’‑TCGAGAAAAAAGCCACCACCTTAATAGACGACTCTCTTGAAGTCGTCTATTAAGGTGGTGGCA‑ 3’；（2）将上述步骤（1）中所合成的shRNA基因的正义链序列和反义链序列进行退火处理形成双链；（3）对LV10载体采用XhoI酶和 Hpa I 酶进行线性化处理；（4）将步骤（2）和步骤（3）产物进行连接构建LV10‑shRNA载体；（5）将步骤（4）所构建的LV10‑shRNA载体转化293T细胞制备慢病毒颗粒；将所制备的慢病毒颗粒感染肿瘤细胞后即可使肿瘤细胞中TNFAIP8基因沉默。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柴立辉，马远方，吴素霞，张赛男，杨菲，李伟华，冯世明，顿国庆，刘广超，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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