The present invention provides methods and compositions that allow a single microRNA (niRNA) to reduce expression levels of at least two members of the same protein and / or gene family. Although a single 21 base pair niRNA can lead to a variety of mRNA cleavage of the gene family can not be silent, unless the gene family can also be 21 single miRNA cracking base to share the same Their natures are much the same. within the region. In some embodiments, all members of a given protein and / or gene family can be disclosed for the construction of miRNA expression by inhibiting, even if they are able to play a role in miRNA 21 base pairs in the region do not have the same Their natures are much the same.. Such methods and compositions employ the miRNA expression construct, which has a structure that gives rise to the highest abundance of miRNA produced by the constructs, miRNA in the form of 22- nucleotides. The construction of 22- nucleotide miRNA and not only reduced the expression level of miRNA target sequence by miRNA expression, but also reduces the expression as a target sequence from the same protein and / or gene family of at least one other sequence.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用人工MICRORNA以沉默基因家族的方法和组合物
本专利技术的领域一般涉及植物分子生物学。更具体地，其涉及降低植物蛋白和/或基因家族中至少两个成员的表达水平的构建体和方法 。
技术介绍
多种真核生物体，包括植物、动物和真菌，都进化了多个RNA沉默途径以保护其细胞和基因组、抵御核酸诸如病毒或转座子的入侵，并在发育过程中或响应于外界刺激调控基因表达(综述见于 Baulcombe (2005) Trends Biochem Sci30:290-293 ;Meins 等人(2005) Annu Rev Cell Dev Biol21:297-318)。在植物中，已显示RNA沉默途径会控制多种发育过程，包括开花时间、叶片形态、器官极性、花卉形态以及根的发育(综述见于Mallory和 Vaucheret (2006)Nat Genet38:S31-36)。所有 RNA 沉默系统涉及由类 RNA 酶 III 的酶，在植物中被称为Dicer或类Dicer，将双链RNA(dsRNA)加工为21至25核苷酸(nt)的小 RNA(Bernstein 等人(2001)Nature409:363-366 ；Xie 等人(2004)PLoS Biol2E104:0642-0652 ;Xie 等人(2005)Proc NatlAcad SciUSA102:12984-12989 ;Dunoyer 等人，(2005)Nat Genet37:1356-1360)。这些小RNA被掺入至沉默效应子复合物中，其包含Argonaute 蛋白(综述见于 Meister 和 Tuschl ...
【技术保护点】
能够被转录为RNA序列的分离或重组多核苷酸，其中所述多核苷酸包含miRNA表达构建体，其中所述miRNA表达构建体包含：a)miRNA前体主链，所述miRNA前体主链包含编码miRNA的第一多核苷酸片段和编码星序列的第二多核苷酸片段；b)所述第一多核苷酸片段和所述第二多核苷酸片段与所述miRNA前体主链是异源的；c)所述第一多核苷酸片段包含22?核苷酸(22?nt)，所述22?核苷酸(22?nt)具有与RNA水平待降低的靶序列足够互补的序列；d)所述第二多核苷酸片段包含所述第一多核苷酸片段的互补序列，并且还比所述第一多核苷酸片段少至少1个核苷酸，其中22?nt?miRNA是由所述miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA；并且e)由所述miRNA表达构建体产生的所述22?nt?miRNA能够降低所述靶序列和来自相同蛋白和／或基因家族的至少一个其他序列的mRNA水平，所述相同蛋白和／或基因家族的成员不会被针对与22?nt?miRNA相同的区域的21?nt?miRNA所降低。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.09 US 61/484,0331.能够被转录为RNA序列的分离或重组多核苷酸，其中所述多核苷酸包 含miRNA表达构建体，其中所述miRNA表达构建体包含: a)miRNA前体主链，所述miRNA前体主链包含编码miRNA的第一多核苷酸片段和编码星序列的第二多核苷酸片段； b)所述第一多核苷酸片段和所述第二多核苷酸片段与所述miRNA前体主链是异源的； c)所述第一多核苷酸片段包含22-核苷酸(22-nt)，所述22-核苷酸(22_nt)具有与RNA水平待降低的靶序列足够互补的序列； d)所述第二多核苷酸片段包含所述第一多核苷酸片段的互补序列，并且还比所述第一多核苷酸片段少至少I个核苷酸，其中22-nt miRNA是由所述miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA ;并且 e)由所述miRNA表达构建体产生的所述22-ntmiRNA能够降低所述祀序列和来自相同蛋白和/或基因家族的至少一个其他序列的mRNA水平，所述相同蛋白和/或基因家族的成员不会被针对与22-nt miRNA相同的区域的21-nt miRNA所降低。2.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述第一多核苷酸片段在所述第二多核苷酸片段的5'端。3.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述第二多核苷酸片段在所述第一多核苷酸片段的5'端。4.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述miRNA前体主链来自植物。5.根据权利要求4所述·的分离或重组多核苷酸，其中所述植物为单子叶植物。6.根据权利要求4所述的分离或重组多核苷酸，其中所述植物为双子叶植物。7.根据权利要求5所述的分离或重组多核苷酸，其中所述单子叶植物为玉米。8.根据权利要求6所述的分离或重组多核苷酸，其中所述双子叶植物为大豆。9.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述miRNA前体主链包含如SEQID NO:9或16中任一个所示的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:9或16具有至少90%序列同一性的序列，其中所述序列保留miRNA前体主链活性。10.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述靶序列编码肌醇半乳糖苷合成酶(GAS)蛋白和/或基因家族的成员。11.根据权利要求10所述的分离或重组多核苷酸，其中所述第一多核苷酸片段包含SEQ ID NO:2中所示的序列，并且所述第二多核苷酸片段包含SEQ ID NO:6中所示的序列。12.根据权利要求10所述的分离或重组多核苷酸，其中由所述miRNA表达构建体产生的所述miRNA包含SEQ ID NO:1中所示的序列。13.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述靶序列编码Λ12脂肪酸去饱和酶2蛋白和/或基因家族的成员。14.根据权利要求13所述的分离或重组多核苷酸，其中所述第一多核苷酸片段包含SEQ ID NO:4中所示的序列，并且所述第二多核苷酸片段包含SEQ ID NO:8中所示的序列。15.根据权利要求13所述的分离或重组多核苷酸，其中由所述miRNA表达构建体产生的所述miRNA包含SEQ ID NO:3中所示的序列。16.重组DNA构建体，包含权利要求1的分离或重组多核苷...
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