两条水稻MAR序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供了两条水稻来源的MAR的核苷酸序列，所述MAR的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述MAR的核苷酸序列包括MAR序列的核心基元；所述MAR序列的核心基元包括富含AT、复制起始位点、弯曲DNA、扭结DNA、拓扑异构酶II识别位点、ATC原则和MAR识别特征。本发明专利技术将所述水稻来源的MAR的核苷酸序列连入外源基因的两侧，构建表达载体，并将表达载体转化植株，能够大大地提高外源基因的表达水平和稳定性，有效地降低或消除转基因沉默现象的发生，有助于促进植物转基因技术的发展和应用，具有显著的经济效益和社会效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物基因工程领域，更具体地，本专利技术涉及两条水稻来源的MAR序列及其应用。
技术介绍
植物转基因技术的飞速发展使其成为解决全球性粮食危机、资源短缺、生态恶化和劳动力减少等问题的有效途径，对农业、医药、环保和能源等领域产生了深远的影响。在植物转基因技术的发展过程中，转基因沉默(transgene silencing)的现象是影响其发展的重要因素之一。如何克服转基因沉默的现象已成为植物转基因技术发展的热点之一。目前，研究人员主要通过修饰改造外源基因或者加入调控序列的方法来克服转基因沉默的现象。MAR/SAR (Matrix/Scaffold attachment region or Matrix/Scaffold association region,核基质结合区/核骨架附着区)是真核基因组中能够特异性紧密结合在核基质上的一段DNA序列，在真核基因组中大量存在。现有的研究表明，MAR序列之间不存在序列同源性，没有保守序列，但却含有多个共通的核心基元。这些核心基元包括富含AT、复制起始位点、弯曲DNA、扭结DNA、富含TG、拓扑异构酶II识别位点、植物保守基元、 ATC原则和MAR识别特征等。一般而言，MAR序列均富含AT，其他基元并非每个MAR序列都具备。MAR序列长度波动范围较大,最短的才几十个碱基对,最长的可达近8000碱基对,但多数MAR序列长度位于600至1200碱基对之间。MAR序列和核基质的特异性结合在进化上具有高度保守性，不同物种来源的MAR序列和核基质可以紧密结合。同时，研究也表明， MAR序列大量存在于染色体上，一般都位于基因间隔区，大多数MAR序列与微型反向重复转座元件共存。由于MAR序列本身的特征，不具有保守性和序列同源性，再加上MAR序列分布范围极广泛，数量众多，且大多数MAR序列又不具有较强的外源基因调控功能，因此，要分离和克隆好用的MAR序列是相当困难的。随着生物信息学的发展和基因组测序的完善，诞生了一些新的MAR预测技术，为MAR的分离和克隆提供了一种新的途径。其中的 MarFinder (MAR-Wiz)是由英国科学家Dr. Singh开发的最早用于MAR序列预测的技术,具有更高的预测可靠性。自MAR序列被分离纯化以来，其特征和功能就备受研究人员的关注，研究人员将 MAR序列连在报告基因的两侧进行共转化，发现MAR序列可以在并未改变报告基因拷贝数的情况下使其在受体内高效、稳定表达。目前，MAR序列的作用机制仍无定论，但其调控功能确已被广泛认同。基本认同MAR序列在植物转基因技术中对外源基因的转化效率、表达水平和稳定性以及遗传稳定性都具有明显的调控作用，能有效降低或消除转基因沉默现象的发生。在植物转基因技术中，所有来源于非宿主来源的外源DNA片段都被认为是不安全的，都可能存在生物安全性的问题。选择宿主来源的DNA片段来尽可能替换外源DNA的使CN 102911936 A书明说2/8页用，已经成为目前研究人员在植物转基因技术中的一大趋势。在转基因水稻的研究中，选择水稻来源的MAR序列来调控外源基因的表达被认为是一种更安全的方式。
技术实现思路
鉴于以上情况，为了获得水稻来源的MAR(matrix attachment region,MAR)序列， 降低或消除转基因沉默现象给植物转基因技术发展造成的阻碍和负面影响，本专利技术提供了两条水稻来源的MAR序列，并将其应用于植物转基因技术中，提高了外源基因的表达水平和稳定性，有效地降低或消除了转基因沉默现象的发生。本专利技术提供了两条水稻来源的MAR的核苷酸序列，所述MAR的核苷酸序列如SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 所示。所述MAR的核苷酸序列包括MAR序列的核心基元；所述MAR序列的核心基元包括富含AT、复制起始位点、弯曲DNA、扭结DNA、拓扑异构酶II识别位点、ATC原则和MAR识别特征。本专利技术的另外一个目的在于将所述的水稻来源的MAR的核苷酸序列应用于植物转基因技术中，并获得稳定高效表达外源基因的转基因植株。该应用是将所述水稻来源的 MAR的核苷酸序列连入外源基因的两侧，构建表达载体，并将表达载体转化植株并获得转基因植物； 所述外源基因为GUS基因；所述植物为单子叶植物；所述植物是双子叶植物；所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、高粱、燕麦、黑麦、大麦、小米、糖甘蔗和禾草中的任一种；所述双子叶植物为大豆、荚果、油菜籽、棉花、向日葵、番茄、土豆、甜菜、紫花苜蓿、丁香和花生中的任一种。本专利技术的显著优点本专利技术获得了两条新的水稻来源的MAR序列，并将其应用于植物转基因技术中，能够大大地提高外源基因的表达水平和稳定性，有效地降低或消除转基因沉默现象的发生，有助于促进植物转基因技术的发展和应用，具有显著的经济效益和社会效益。附图说明图I为人工设计合成的多克隆位点短片段的序列及其所包含的限制酶酶切位点。图2为植物表达载体pCAMBIA1300-Ml-济As的质粒图谱。图3为植物表达载体pCAMBIA1300-M2-济As的质粒图谱。图4为阳性对照表达载体pCAMBIA1300-^as的质粒图谱。图5为潮霉素基因Hyg的PCR检测的电泳结果。第I至第3泳道为转 pCAMBIAl300-^5阳性对照转基因水稻的植株；第4至第6泳道为转pCAMBIA1300_Ml-#s 的水稻的阳性植株；第7和第8泳道为非转基因水稻的阴性对照；第9至第11泳道为转 pCAMBIA1300-M2-^5的水稻的阳性植株；第12泳道为ddH20的阴性对照 ’第13泳道为DNA Marker。4图6为转基因水稻叶片的⑶S酶活分析。转Ml水稻是指转pCAMBIA1300-Ml-典s 质粒的转基因水稻；转M2水稻是指转pCAMBIA1300-M2-^as质粒的转基因水稻；阳性对照是指转pCAMBIAUOO^as质粒的转基因水稻；阴性对照是指非转基因水稻。具体实施方式本专利技术的两条水稻来源的MAR序列是通过如下步骤获得的1)利用水稻基因组数据库的信息结合MAR序列预测技术MAR-Wiz的预测分析确定候选的MAR序列；2)根据确定候选的MAR序列设计合成引物，通过PCR扩增的方法从水稻基因组DNA中克隆出候选MAR序列，并经过测序验证；分离和克隆候选MAR序列；3)将分离和克隆到水稻的候选MAR序列经序列分析，验证候选MAR序列是否符合MAR 的序列特征；4)将验证后的候选MAR序列构建于植物转基因(报告基因GUS)的两侧，并将构建物转化水稻，获得转基因水稻植株；5)通过检测转基因水稻叶片中报告基因GUS的表达水平与不含MAR序列的对照转基因水稻的比较，来分析和判断候选MAR序列是否提高了外源基因的表达水平和稳定性，从而确定候选MAR序列是否为所需要的水稻MAR序列。以下结合具体实施例进一步阐述本专利技术，但是本专利技术不限于此。本专利技术所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。(以下实施例的实验材料为日本晴水稻(Piyza sativa L. japonica cv.))实施例I :候选MAR序列的筛选根据AT-Richness、高表达基因的含量，选取富含AT-Richness和高表达基因的染色体用于筛选候选MAR序列。在BGI (Beijing Gen本文档来自技高网...

【技术保护点】
一条水稻来源的MAR的核苷酸序列，其特征在于：所述MAR的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王锋，胡太蛟，武建伟，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：