本发明专利技术公开了一种细胞周期G1期报告基因。本发明专利技术提供了一种重组载体，包括细胞周期G1期报告基因和抗生素抗性基因，将该载体转染待检测细胞后，通过检测报告基因的表达可确定细胞是否处于细胞周期G1期。本发明专利技术可用于体内监测细胞周期的变化，克服了流式等技术只能在细胞水平观察细胞周期的缺点，为动物实验提供了一个强有力的工具。并且，利用本发明专利技术可对药物疗效进行早期评价，缩减药物的研发时间和减少研发费用，克服了传统影像学只能从解剖水平对疾病描述的局限，及核素标记存在的细胞毒性的局限。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和基因工程领域，具体地讲，涉及一个报告基因。
技术介绍
报告基因是一种编码某种易于检测的蛋白质或酶的基因，把报告基因的编码序列与其他目的基因融合，在调控序列控制下进行表达，通过报告基因的表达产物可标定目的基因的表达状况。报告基因技术因具有高灵敏度、检测方便等特点，被广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多种细胞事件。随着技术和检测方法的进步，荧光素酶以其能够将细胞内基因的活性可视化和对细胞的无毒性而越来越成为主流，并且荧光素酶报告基因技术已被广泛应用于体外监测细胞生长和增殖。细胞的正常生长、分裂，必须依次经过准备阶段的间期和有丝分裂期，细胞周期的正常运行，受到特异的细 胞周期素和细胞周期依赖性蛋白激酶的精确调控，同时，还伴随着多种特异性分子的合成和降解。基于此，将荧光素酶与某一细胞周期特异性分子融合，便可通过观察荧光素酶报告基因反映特异性分子的表达情况，进而间接地了解细胞周期的变化及增殖情况。Cyclin E和细胞周期依赖的基因调控之间密切相关，在正常细胞增殖调控中起重要作用。Cyclin E与⑶K2结合是S期启动的必要条件。活化后的cyclin E-⑶K2复合体通过磷酸化其底物蛋白，如视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)、pRb家族成员P107、⑶C6、定位于AT位点的核蛋白P220 (NPAT)等，使DNA合成得以进行并在Gl末期使细胞越过限制点(R点)进入S期。Cyclin E-⑶K2的激酶活性受到严格调控的，在复制过程中，当DNA 损伤或出现错误时，可激活一些针对cyclin E-CDK2活性的抑制因子，如P21( cipl)、P27 ( kipl)和P57( kip2)等。这些激酶活性的抑制因子结合cyclin E-⑶K2使其失去激酶活性，不能磷酸化其底物，DNA的合成从而不能被启动，则细胞停滞在Gl期。同时cyclin E 的表达水平受Fbw7的泛素化调节，在S期迅速被Fbw7介导的泛素化降解。细胞周期蛋白E (cyclin E)在Gl中期开始表达，在G1/S期含量达高峰后逐渐降解消失，其结合并激活周期蛋白依赖性激酶(⑶K) 2，cyclin E/(⑶K) 2激酶复合物通过磷酸化其下游底物如pRb、⑶C6、NPAT和P107等使细胞启动DNA合成，不可逆转地进入S期。 因此，cyclin E的表达变化可准确地反映出细胞周期由Gl期向S期转变的过程，将荧光素酶与cyclin E融合，便可构建出反映细胞周期Gl期的报告基因。根据以前的研究，细胞周期的分析主要基于两种生物学技术，一种是5溴脱氧尿 P密唳核苷(5-Bromodeoxyuriding, BrdU)掺入法,其主原理是5_BrdU可在S期代替胸腺U密啶(T)渗入正在复制的DNA分子。另一种是应用流式细胞术进行细胞周期分析，其原理是利用各期的DNA含量的不同。但两种方法都只能在细胞水平观测细胞周期的变化，而无法实现体内细胞周期监测。近年来，通过体内细胞标记进而实现体内细胞周期监测的方法不断涌现，如溴脱氧尿苷和放射性核素等标记细胞和分子，但这些技术却存在细胞毒性作用， 而且随着细胞不断分裂，标记信号逐渐消失。细胞周期报告基因则因其对细胞无毒性，可进行体内细胞周期监测而很好地克服了以往细胞周期分析技术的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是设计一种新的报告基因，用于检测细胞周期的变化。本专利技术的另一个目的是提供上述报告基因在检测细胞周期的变化中的应用。本专利技术的另一个目的是提供上述报告基因在分子生物学、抗肿瘤药物疗效、转基因动物等方面的研究应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案实现的本专利技术提供一种检测细胞周期Gl期的报告基因，包含启动子、细胞周期蛋白E基因和标记基因，本专利技术所述标记基因是一类能够对目的基因(本专利技术的cyclin E基因)起到特异性标记作用的基因，可以通过体内监测标记基因的表达产物来判断目的基因的表达情况， 从而判断细胞周期变化。在检测标记基因表达产物时，不需要杀死动物，从细胞水平上判断基因是否表达，只需要向动物体内注射标记基因表达广物的底物，当标记基因表达后，表达产物遇到底物即可发生肉眼可见的反应。例如，当荧光素酶基因表达后，向动物体内注射荧光素后，荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。因此，本专利技术中所述标记基因并不局限于荧光素酶基因，基于同样原理的绿色荧光蛋白基因和β-葡萄糖苷酸酶基因等都可以作为标记基因。在优选实施方式中，所述标记基因包括荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因或 β-葡萄糖苷酸酶基因。在优选实施方式中，所述一种检测细胞周期Gl期的报告基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO: I 所示。本专利技术提供一种重组载体，具体为一种重组质粒，其如图I所示。代表报告基因的是pro-cyclinE-luc的序列，序列从34至4289共4256bp,具有报告细胞是否处于Gl期的能力。34到1425是启动子(promotor cyclin E,共1392bp), 1450至2634是细胞周期蛋白 E基因(共1185个bp)，2665至4289是荧光素酶基因(共1625bp)。该重组载体的构建方法为采用PCR的方法从基因组中扩增出cyclin E基因并对它进行分析，然后克隆到10_4 cyclinE promotor质粒上,并转化到大肠杆菌中，提取质粒，并对它进行酶切和测序分析， 再将鉴定正确的质粒转染到细胞中进行各项功能分析。本专利技术提供一种检测细胞周期是否处于Gl期的方法，其包括以下步骤Ca)用上述构建成功的重组载体转染待检测细胞；(b)检测细胞周期蛋白E是否表达当检测到标记基因表达产物时，即表明细胞周期蛋白E表达，则可判断细胞处于细胞周期Gl期；当检测不到标记基因表达产物时，即表明细胞周期蛋白E没有表达，则可判断细胞不处于细胞周期Gl期；在优选实施方式中，该方法中所述标记基因包括荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因或 β-葡萄糖苷酸酶基因。本专利技术的有益效果本专利技术以报告基因的表达来观测细胞周期的变化的策略有如下几个优点I、不需要杀死动物，可从体内监测细胞周期的变化，克服了流式等技术只能在细胞水平的观察细胞周期的缺点，为动物实验提供了一个强有力的工具。2、可早期监测疾病的增殖情况，能达到对药物疗效进行早期评价，缩减药物的研发时间和减少研发费用。克服了传统影像学只能从解剖水平对疾病描述的局限，及核素标记存在的细胞毒性的局限。附图说明图I 为 pro-cyclinE-luc 质粒构建2 SpcDNA HA cyclin E质粒PCR产物电泳结果图3为10-4 cyclin E promotor质粒酶切结果图4为pro-cyclinE-luc质粒酶切结果图5为稳定转染Hela pro-cyclinE-luc细胞株A、突光素酶活性结果Ekwesternblot结果图6为细胞周期同步化后结果A、荧光素酶活性检测结果B、westernblot结图7 Fbw7 siRNA干扰后结果荧光素酶活性结果图8为蛋白酶体抑制剂MG132 (control、20uM、40uM)作用后实验结果A、荧光素酶活性结果B、westernblot结果具体实施例方式下面结合附图和实施例本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测细胞周期G1期的报告基因，其特征在于包含启动子、细胞周期蛋白E基因和标记基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张国君，魏晓龙，郭翠萍，
申请(专利权)人：张国君，
类型：发明
国别省市：
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